程传东 赵淑江

[摘要]为了加深对舟山东极海域微型真核浮游生物优势物种与相关海洋环境因子之间相关性的了解。于2016年6月和2017年2月采取夏季和冬季两季海水样品。通过过滤滤膜收集海水中3～20μm的浮游生物。基于18S rDNA进行高通量测序得到相关数据，并利用SPSS17.0相关性分析探讨海洋生态因子与微型真核浮游生物之间的关系。微型真核浮游生物群落组成在各个站位之间不尽相同，但都主要包括Cryptomonadales、Ciliophora、Ascomycota三大优势物种。SPSS相关性分析结果表明微型真核浮游生物群落结构和多样性情况与所在站位的环境因子息息相关，夏季优势物种主要由Ascomycota、Ciliophora組成，冬季优势物种主要由Cryptomonadales组成。

[关键词]舟山东极海域；微型真核浮游生物；相关分析；环境因子；优势度

[中图分类号]Q178 [文献标识码]A

微型真核浮游生物通常是指粒径在3～20μm之间的真核浮游生物，是构成海洋微型食物链和生物量的重要组成部分，在海洋生态系统中占有十分重要的地位。随着显微技术、分子生物学等新的技术手段被越来越广泛地应用到海洋浮游生物领域，人们发现了以前未知的个体微小的真核生物。许多微型真核浮游生物无明显的外部特征，大多呈球形或近球形，准确鉴定其种类仍存在很大的困难。微型浮游生物的研究最早始于英国，直到近几十年来，基于现代观测技术和实验技术的进步，微型浮游生物的研究才逐渐得到更多重视并且有了较快的发展。目前我国对海洋微型真核生物的研究主要集中于时空分布和丰度检测层面，对其分子多样性研究仍颇为匮乏。微型真核浮游生物作为初级生产者、细菌捕食者和较大型生物寄生者，在维持生态系统稳定和群落结构多样性中起核心作用。因此，研究微型真核浮游生物对舟山海域水生生态系统中的物质循环和能量流动有着重要意义，有助于更多地了解水体中微生物网的结构和功能。

本研究以分子生物学技术为研究方法，基于高通量测序手段，揭示目标海域的微生物群落多样性情况，同时应用SPSS17.0统计学软件对其数据进行相关性分析，探索海洋真核微型浮游生物群落结构与环境因素之间的关系，对微型真核浮游生物的环境影响因素进行讨论。本研究将为进一步了解海洋真核微型浮游生物群落结构及多样性提供了分子生物学层面的数据支持，并对微型真核浮游生物可作为一些经济鱼类的饵料持乐观预测，值得研究者们的深入研究。

1 样品采集及预处理

2016年7月及2017年2月在舟山东极海域设置6个代表性站位采集夏、冬两季的海水样品，共12个海水样品，各采样站位坐标分别为S1（122.6982，30.1953）、S2（122.6973，30.2021）、S3（122.6956，30.2064）、S4（122.6953，30.2125）、S5（122.6921，30.2191）、S6（122.6869，30.2285）。夏季样品名分别是X1、X2、X3、X4、X5、X6，冬季样品名分别是D1、D2、D3、D4、D5、D6（见图1）。

1.1 生态因子及微型浮游生物样品采集

在水样采集站点，利用便携式 HQ-30D 溶氧仪立即测定各采样站点的溶解氧（DO）和水温（Temperature），用便携式盐度计测定盐度，用记录表单记录下来；各站点分别采集表层（0.5 m）海水并经过脚踏式真空抽滤装置（富林004）进行抽滤，先后经过20μm和3μm混合纤维素滤膜（Millipore公司）分子膜过滤，富集海洋细菌于膜上，然后把过滤后的分子膜放置于冻存管中并立即加入终浓度为0.5%的戊二醛混匀固定。再放入液氮罐中保存并带回实验室，然后转移到-80 ℃超低温冰箱保存直到实验开始。

1.2 DNA的提取及检测及PCR扩增

取出保存分子膜的冻存管并在常温下待其解冻，在无菌的条件下剪碎。采用水体DNA试剂盒（OMEGA Water DNA Kit：D525-01）进行提取，DNA提取完成后用紫外分光光度计（NANO Drop 2000）检测其浓度和纯度，合格后进行PCR扩增，采用扩增引物（SSU0817F_SSU1196R），PCR反应体系为95 ℃预变性3 min，95 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循环35次，72 ℃延伸7 min。采用20 ul反应混合液，扩增产物用2%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。将DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司在Illumina MiSeqTM 平台上进行高通量测序。为了提高分析结果的质量，按照97%相似性进行OTU聚类。还可以提供环境因子，进行相关性分析。

2 结果

2.1 东极海域微型真核浮游生物优势物种组成

通过测序后所得数据可以发现以下规律：东极海域总体微型真核浮游生物种类数量较多，每个站位的真核微生物种类比较繁多且不尽相同，但同季节各站位微型真核浮游生物优势物种相似性较大。如冬季优势物种：Cryptomonadales、Ciliophora，在各站位所占比例处于85.8%～90.7%之间；夏季优势物种：Ascomycota在各站位所占比例处于59.9%～94.6%。由表1和表2可以发现，以上三种优势物种无论冬季还是夏季都占据着前三的平均优势度，特别是冬季的Cryptomonadales以及夏季的Ascomycota，都占据着绝对的优势比例。因此可以说明，这三个物种在该海域微型真核浮游生物中占据着主导地位（见表1和表2）。

2.2 丰度及多样性

从OTU聚类结果来看，本次实验共得到42个门（phyla），69个纲（Class），193个目（order），115个科（family），138个属（genus）。本文通过测序在门水平做出了群落的Heatmap图，该图可以通过颜色梯度及相似程度来直观的反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性，可以比较直观的展现出各个站位的物种的相对丰度及多样性的情况（见图2），图中颜色越深说明该细菌门类丰度越高。在门水平下，冬、夏两季的物种组成比例差异相对明显，从其中可以清楚地看出所占比例较大的有三类物种：Cryptomonadales、Ciliophora、Ascomycota。明显地，夏季的Ascomycota丰度最高，冬季则是Cryptomonadales丰度最高，其次是Ciliophora。

2.3 微生物與环境因子相关性分析

采用SPSS17.0统计软件，筛选出生物量相对较多的几种优势种的生物量与水温（T）、溶解氧（Do）、PH值、盐度（Salinity）四个环境因子进行Person相关性分析，结果表明：（1）该海域微型真核浮游生物优势种与所列环境因子相关性不尽相同。从表3中可以看出，优势种Ascomycota只与T环境因子为极显著正相关，与Do和Salinity为极显著负相关，与其他物种呈极显著负相关（P<0.01），Ascomycota、Ciliophora两个优势物种都与PH和Do呈极显著正相关，与T呈极显著负相关（P<0.01）；环境因子之间PH与Do呈极显著正相关，与T呈极显著负相关，Do与T呈极显著负相关（P<0.01）；各参数指标间的相关系数见表3。

3 讨论与结论

3.1 舟山东极海域海洋微型浮游生物优势物种的丰度影响分析

由上述研究可知，舟山东极海域冬、夏两季微型真核浮游生物优势物种主要有3种，都在各自季节占据着绝对的比例，分别为Cryptomonadales、Ciliophora以及Ascomycota。但不难发现，冬季优势物种Cryptomonadales和Ciliophora在各站位所占比例处于85.8%～90.7%之间，变化区间不大，有力地说明了该两物种在该海域的优势地位，而夏季优势物种Ascomycota在各站位所占比例处于59.9%～94.6%，变化幅度较大，从1站位的94.6%到6站位的59.9%，表现出了该优势物种丰度的变化较大，而从1到6号站位大致是从近岸到远岸，可能这些距离也导致着站位间的海水生态环境的不同，间接地影响了夏季该优势物种的丰度值。舟山东极海域蕴含着较为丰富的微型真核浮游生物群落，为全面认识舟山功能海域中真核微生物多样性奠定基础。

3.2 真核微型浮游生物多样性与环境因子之间的关系

微型真核浮游生物与环境变量之间有着相互影响、相互支撑的作用，每片海域定然会有着不同的海域环境，因此其环境因子也会相应的有所不同，进而影响着不同海域微生物多样性的程度。比较常被引用的环境因素主要包括温度、盐度、DO和无机营养盐等。在本研究中，毫无疑问，温度环境因子是我们考虑的首要因素，选择冬夏两季也是由此而来。相关系数矩阵中所得出的结果也与实际情况相符，两季的样品很明显地呈现出负相关，与夏季样品有着极强的相关性的环境因子有Do、PH，而与冬季样品表现出较强的相关性的环境因子有Salinity和T。其中，Salinity环境因子与这些优势种无显著相关，影响较小。

综上，舟山东极海域的微型真核浮游生物优势种在冬夏两季虽有差异，但都有较为丰富的多样性；同时在环境影响因子方面，本文只选用了四个相对比较常用的且影响力比较明显的环境因子，因此该海域环境因子的相关分析也值得学者们的进一步研究，而目前有关东极海域微型真核浮游生物的相关研究甚少，所以本研究也可以为研究者们的进一步研究提供一些数据及经验上的帮助，目前的分子生物学技术迅速发展，如本研究所使用的高通量测序等，可以为研究者们提供效率高、成本较低、数据准确的先进技术，使海洋微生物的研究能够更好地发展。

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