潘飞龙 高娅北 王松峰 宋朝鹏 孙曙光 杨晓亮 申洪涛

摘 要：为了探究不同品种烤烟成熟期糖代谢的变化规律，明确烟叶品质形成的分子作用机理。以烤烟品种秦烟96、豫烟6号和K326为试验材料，测定分析了烤烟成熟期水溶性糖组分（葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、还原糖和可溶性总糖）含量、糖代谢关键酶活性及基因表达的变化。结果表明，3个品种烤烟水溶性糖组份含量变化趋势基本一致，各水溶性糖（蔗糖除外）含量呈先升高后降低的变化趋势，烟叶成熟时其含量达到峰值；蔗糖含量呈双峰波动，烟叶成熟时蔗糖含量较低。烟叶打顶至适熟阶段，SPS和AI酶活性对烟叶中水溶性糖的积累贡献最大，NtINV对烟叶糖代谢起主要调控作用；当烟叶由适熟至过熟时，AI酶活性主要参与烟叶糖代谢活动，而SS和SPS则对蔗糖积累起重要作用，NtSS和NtSPS对烟叶糖代谢起主要调控作用。同一生态环境和栽培条件下，豫烟6号内含物质充实，具有较高的水溶性糖分含量，SPS和AI酶活性的差异可能是造成烟叶糖组分及含量不同的重要原因。

关键词：烤烟；成熟期；糖代谢；酶活性；基因表达

中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2018）05-0047-10 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.007

Abstract： In order to explore the changes of sugar metabolism in different varieties of flue-cured tobacco， clarifying the molecular mechanism of the formation of tobacco leaf quality， the flue-cured tobacco varieties Qinyan 96， Yuyan 6 and K326 were taken as the sample materials to determine the changes of water-soluble sugar components （glucose， fructose， maltose， sucrose， reducing sugars， and total soluble sugars）， key enzyme activities in sugar metabolic and gene expression changes at mature stage. The results showed that the trend of change in water soluble sugar content in the three varieties of flue-cured tobacco was basically the same. The contents of water soluble sugars （except sucrose） first increased and then decreased， reaching the peak when tobacco leaves matured. The sucrose content showed a bimodal fluctuation， and the sucrose content was the lowest when the tobacco was mature. The activity of SPS and AI enzymes contributed the most to the accumulation of water-soluble sugars in tobacco leaves from topping to proper maturity. NtINV played a major role in regulating sugar metabolism in tobacco leaves. When tobacco leaves were from ripe to overripe status， AI enzyme activity was mainly involved in tobacco sugar metabolism， while SS and SPS played an important role in sucrose accumulation. NtSS and NtSPS played a major role in regulating sugar metabolism. Under the same ecological environment and cultivation conditions， the content of metabolites in Yuyan 6 was enriched and had high water-soluble sugar content. The difference of SPS and AI enzyme activity may be an important reason for the different sugar components and content of tobacco leaves.

Keywords： flue-cured tobacco； mature stage； sugar metabolism； enzyme activity； gene expression

糖代謝是烤烟植株生命活动最基本的初生代谢之一[1]，对烟叶的生长发育、干物质积累有重要影响[2]。烤烟成熟期糖代谢的平衡与协调，最终影响烟叶品质。此外，还原糖也是影响烟叶品质的重要化学成分，可调节烟气酸碱平衡，增加烟叶香吃味[3]。因此，研究烤烟成熟期水溶性糖含量动态变化规律、糖代谢关键酶活性及基因表达模式对探究烟叶品质形成的机理有重要意义。

烟叶内可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。蔗糖是烟叶内光合作用的主要产物，在碳同化物积累、运输和贮藏中发挥重要作用[4]。蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和转化酶（Invertase，INV）是蔗糖代谢关键酶，其活性对植物糖代谢有重要影响[5-6]。蔗糖转化酶的活性可作为碳代谢的标志[7]，其不可逆地催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖，参与韧皮部的卸载与库的建立，同时也与烟叶生长和器官建成有关[8-9]。蔗糖磷酸合成酶控制植物体内碳素的分配和流向，其活性与蔗糖积累趋势相似，在糖代谢中起关键作用[10]。前人通过对大豆、小麦、水稻等作物研究发现，叶片糖代谢与相关酶或基因之间密切相关[11-13]。就烟叶糖代谢研究而言，王红丽等[14]研究发现，糖代谢相关基因如蔗糖合成酶基因（NtSS）、蔗糖磷酸合成酶基因（NtSPS），转化酶基因（NtINV）随着烟草生育期的进行逐渐增强。牛德新等[15]研究发现，烤烟移栽后90 d，高氮处理显著增强INV的表达量。史宏志等[16]研究发现，烟叶发育的不同阶段各酶活性不同，转化酶活性先升高后降低，旺长期时转化酶活性达到峰值。贾宏昉等[17]研究发现，植烟土壤中增施腐熟秸秆可增强蔗糖代谢相关基因NtSuS等的表达，促进成熟期烟叶的碳代谢，进而提高烟叶品质。

目前对烟叶糖代谢的研究集中在相关酶活性或者相关基因等单方面因素，对于烤烟成熟期糖代谢物质变化、关键酶活性及基因表达模式系统性的研究鲜有报道。本研究以秦烟96、豫烟6号和K326为材料，测定烟叶成熟期水溶性糖含量及糖代谢关键酶活性变化，并利用实时荧光定量PCR技术测定关键酶基因的表达规律，旨在系统探究烟叶品质形成的分子作用机理，为优质烟叶生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年在河南省洛阳市洛宁县小界卫洼烟叶标准化生产示范田（东经111°38′，北纬34°26′）进行，选用当地主栽烤烟品种秦烟96、豫烟6号和K326为试验材料。烟苗于2017年5月8日移栽，单株有效叶数18～20片，以培育“中棵烟”目标要求进行田间管理。试验土壤为黄棕壤，土壤基本理化性质：pH 7.26，有机质13.52 g/kg，碱解氮75.18 mg/kg，速效磷9.17 mg/kg，速效钾164.37 mg/kg。试验田内统一技术标准，实施漂浮育苗、平衡施肥、地膜覆盖、清棵培土、化学抑芽等技术措施，采用机械化作业，水肥一体化灌溉技术，其中水肥一体化采用烟叶水肥一体化自动注灌设备（贵州瑞欣现代农业有限公司）。烟田施氮量为72 kg/hm2，施用肥料为烟草专用复合肥[云南云叶化肥股份有限公司，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1∶2]。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，每个品种设置6个取样时期，重复3次，共54个小区，小区面积16.5 m2，行株距1.1 m×0.5 m，每个试验小区植烟30株。取样时选取不同小区内长势均匀一致的烟株，每个品种各6株，试验部位为中部叶（10～12叶位），烟叶打顶当天即移栽后65 d开始取样，随后每10天取样一次，共取样6次。每次取样烟叶大小均匀一致，去除主脉，选取第6至第7支脉叶肉组织，混合样品，每份样品约5 g，置于液氮中速冻，然后于-80 ℃冰箱中保存，用于酶活性和基因表达量分析；另一部分烟叶先于105 ℃下杀青20 min， 再65 ℃烘干，研磨，过60目筛保存，用于化学成分测定。每个时期进行3次重复。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 可溶性糖含量测定 烟叶可溶性糖的提取采用牛景等[18]方法，葡萄糖、果糖和蔗糖的含量测定采用高效液相色谱法[19]（Waters1525 HPLC，USA）测定，色谱条件：Carbohydrate Analysis 84038色谱柱，柱温82 ℃，流速0.5 mL/min，流动相为重蒸水，常温示差折光检测器，Waters Breeze TM软件控制HPLC运行和进行数据采集分析。烟叶总糖和还原糖采用AA3型连续流动化学分析仪（德国BRAN + LUEBBE公司生产）测定，參照行业标准YC/T159—2002方法。

1.3.2 糖代谢关键酶活性测定 蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）（分解方向）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）、酸性转化酶（acid invertase，AI）和中性转化酶（neutral invertase，NI）活性分别按照苏州科铭生物技术有限公司生产的相应酶试剂盒说明书方法进行测定。

1.3.3 糖代谢相关基因表达量分析 采用改良CTAB法[20]提取样品内总RNA，通过随机引物法反转录合成cDNA[21]。从GenBank核酸数据库中检索烟草蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖转化酶（INV）序列，利用Roche LCPDS2设计引物，引物列表见表1。其中烟草核糖体蛋白基因L25[22]作为内参基因。使用HiScript? II qRT SuperMix II试剂配制反应体系于PCR仪（ABI9700）中合成第一链cDNA。按照Invitrogen公司的Real Master Mix（SYBR Green）试剂盒操作指导，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法检测基因的相对表达量。反应程序为：95 ℃预热5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环40次。每个样品均设置3次重复。采用2–ΔΔCt算法[23]对试验结果进行分析。

1.4 数据统计分析

试验数据用Microsoft Excel 2010进行整理，用Origin 9.1进行作图，用SPSS 22.0统计软件进行Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1 不同品种烤烟成熟期水溶性糖组份含量变化

如图1a所示，3个品种烤烟成熟期葡萄糖含量变化趋势一致，先升高后降低；秦烟96、豫烟6号和K326烟叶葡萄糖含量均于移栽后95 d最高，分别达到21.4、22.3和20.9 mg/g；烟叶成熟后（移栽后95 d）葡萄糖含量逐渐降低。如图1b所示，秦烟96果糖含量在成熟期含量高于豫烟6号和K326，烟叶移栽后85 d之前果糖积累速率较快，移栽后95 d其含量快速降低，烟叶成熟时豫烟6号和K326果糖含量差异不显著。与葡萄糖和果糖含量相比，烟叶内麦芽糖含量较低（图1c），3个品种烤烟成熟期麦芽糖含量变化趋势一致，呈单峰波动，烟叶成熟时麦芽糖含量达到最高，不同品种烤烟麦芽糖含量差异不显著。如图1d所示，烟叶成熟期蔗糖含量呈双峰变化趋势，移栽后95 d，蔗糖含量最低，随着生育期的进行，蔗糖含量稍有增加随后又逐渐减少；豫烟6号在成熟期具有较高的蔗糖含量。烟叶成熟期还原糖含量与葡萄糖、果糖和麦芽糖含量变化趋势相似，如图1e所示，烟叶还原糖含量随着烟叶的成熟先升高后降低，移栽后95 d时，还原糖含量达到峰值，此时豫烟6号还原糖含量最高（44.2 mg/g），其次为K326（43.1 mg/g）和秦烟96（41.5 mg/g）。3个品种烤烟可溶性总糖含量在移栽后85 d达到最大（图1f），随后其含量呈不同程度下降；成熟期豫烟6号可溶性总糖含量均显著高于秦烟96和K326。

2.2 不同品种烤烟成熟期糖代谢关键酶活性变化

如图2a所示，在秦烟96、豫烟6号和K326烟叶中，SS活性（分解方向）具有相同的动态变化趋势，成熟期呈先上升后下降再上升的变化趋势；秦烟96和K326烟叶SS活性在移栽后85 d最高，分别为2.710和2.421 mg/（g·min），而豫烟6号SS活性在移栽后95 d达到最高，为2.692 mg/（g·min），之后活性逐渐下降，至移栽后105 d，SS活性又快速升高。

不同品种烤烟SPS酶活性在成熟期呈先上升后波动降低的变化趋势（图2b），移栽后75 d，SPS活性最高；秦烟96和K326烟叶SPS活在烟叶成熟时（移栽后95 d）最低，分别为0.314和0.301 mg/（g·min），随后SPS活性略有回升，而豫烟6号SPS活性在烟叶成熟时则显著高于秦烟96和K326，为0.361 mg/（g·min）。移栽后115 d，3个品种烤烟SPS活性差异不显著。

秦烟96和豫烟6号烟叶AI活性变化趋势相同（图2c），呈单峰波动趋势，移栽后85 d，烟叶AI活性最高；K326烟叶AI活性与秦烟96和豫烟6号AI活性变化趋势相似，但其AI活性峰值在移栽后95 d；烟叶成熟时（移栽后95 d），3个品种烤烟AI活性存在显著差异。与AI活性相比，在整个烟叶成熟阶段，叶片内NI活性始终显著低于AI酶活性（图2d），烟叶内NI活性较低、变化幅度较小；随着烟叶的成熟，叶片内NI活性略有下降；移栽后95 d之前，豫烟6号NI活性略高于秦烟96和K326，之后其NI活性差异不显著。

2.3 不同品种烤烟成熟期糖代谢相关基因表达量分析

如图3所示，通过对不同品种烤烟成熟期烟叶糖代谢相关基因（NtSS、NtSPS、NtINV）表达量的分析发现，在烟叶整个成熟阶段中，NtSS的表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势，移栽后85 d叶片内NtSS表达量达到第一个峰值，此时豫烟6号NtSS表达量最高；烟叶成熟时（移栽后95 d），K326叶片内NtSS表达量显著高于秦烟96和豫烟6号。蔗糖磷酸合成酶基因NtSPS表达量研究表明，移栽后105 d之前，各品种烤烟叶片内NtSPS表达量的上调与下调变化规律不明显，但移栽后115 d叶片内NtSPS的表达量显著上调。不同品种烤烟叶片内NtINV的表达量变化趋势与NtSS相似，在烟叶成熟过程中呈先升高后降低再升高的趋势，但不同品种烤烟NtINV的表达量在不同成熟时期差异较大；烟叶成熟时，豫烟6号NtINV表达量显著高于秦烟96和K326。

2.4 烟叶成熟期糖代谢关键酶活性、基因表达量与水溶性糖含量相关性

由表2可知，煙叶打顶至适熟阶段，大部分水溶性糖（蔗糖除外）含量之间呈正相关，葡萄糖、果糖、麦芽糖与还原糖含量之间达显著或极显著正相关水平；而蔗糖含量与各水溶性糖含量之间相关性较弱。烟叶适熟至过熟阶段，各水溶性糖含量之间相关性变化不大，与烟叶打顶至适熟阶段水溶性糖含量之间相关性相似。

通过对烤烟成熟期糖代谢关键酶活性与相关基因表达量之间的相关分析，结果显示（表3），烟叶打顶至适熟阶段，SS、SPS与AI活性之间呈正相关，SS与AI之间达极显著正相关水平（r=0.912，p<0.01）；NtSS、NtINV与SS、AI活性之间相关性均达到极显著水平。烟叶适熟至过熟阶段，大部分酶活性之间呈负相关；NtSS、NtINV与各酶活性之间相关性减弱，而NtSPS与AI、NI活性之间相关性则显著增强；NtINV与NtSS、NtSPS之间相关性显著减弱。

如表4所示，分别测定分析了烤烟打顶至适熟、适熟至过熟发育过程中糖代谢关键酶活性、基因表达量与水溶性糖含量之间的相关性，结果表明，烟叶打顶至适熟阶段，SS、SPS酶活性与水溶性糖含量之间呈正相关；AI酶活性与各水溶性糖（蔗糖除外）含量之间达显著或极显著正相关水平；大部分糖代谢相关基因与水溶性糖含量之间呈正相关，其中NtINV与各水溶性糖（蔗糖除外）含量之间相关性最强，分别达显著或极显著正相关水平。当烟叶由适熟至过熟时，SPS酶活性与各水溶性糖含量之间相关性减弱，而AI酶活性与各水溶性糖含量之间依然保持较高的相关性；NtSS、NtSPS与各水溶性糖含量之间相关性显著增强，且呈负相关水平；NtINV与各水溶性糖含量之间相关性减弱。

3 讨 论

烤烟成熟期糖代谢活动对烟叶品质有重要影响[24]，糖分的运输和分配是烟叶发育的物质基础，决定了烟叶的产量和品质。烤烟糖代谢受遗传因素、环境条件和栽培措施等的共同影响[25]，是一种多基因调控与环境因素交互作用的结果。张晓远等[26]研究表明，云烟87中部叶成熟过程中叶片还原糖和总糖含量相对较低，移栽后60 d其含量逐渐升高，烟叶成熟时含量最高，然后迅速下降。杨宇虹等[27]研究表明，水田烤烟烟叶果糖含量在旺长期最低，烟叶成熟时果糖含量显著增加。本研究结果表现出相似的变化规律，烟叶从移栽后65 d至115 d的成熟过程中，3个品种烤烟水溶性糖组份含量变化趋势基本一致，各水溶性糖（蔗糖除外）含量呈先升高后降低的变化趋势，烟叶成熟时（移栽后95 d），其含量达到峰值；豫烟6号在烟叶成熟时具有较高的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性总糖含量，说明成熟期豫烟6号糖代谢较强，这可能与烤烟品种自身遗传因素有关。烤烟成熟期蔗糖含量呈双峰波动的变化规律，这与魏庆华等[28]研究的成熟期蔗糖含量呈单峰曲线表现不同，这可能与烟叶成熟阶段蔗糖大量转化为淀粉等碳水化合物有关。

植物果实发育期间糖分积累强度与糖代谢相关酶活性紧密相连[29]，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶控制植物体内碳素的分配和流向，可调控叶片中蔗糖的合成及总糖的积累；蔗糖转化酶不可逆地催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖，参与烟叶生长及器官建成。王树会等[30]、贾宏昉等[17]研究表明，成熟期烟叶INV活性呈单峰变化，移栽后75～85 d其酶活性达到最大。本研究发现，秦烟96、豫烟6号和K326的酸性转化酶（AI）活性变化趋势相似，呈单峰曲线，与前人研究结果相似，但不同品种烤烟AI酶活性达到峰值的时期略有不同；烟叶成熟后，3个品种烤烟AI活性快速下降，说明烟叶进入衰老阶段，叶片糖代谢减弱。3个品种烤烟NI活性在整个成熟期均较低，变化不显著，说明NI在烤烟成熟期非烟叶糖代谢关键酶，进一步说明成熟期烤烟糖代谢活动主要发生在液泡中[31]。

大量研究表明糖代谢相关基因参与调控了烟叶的糖代谢[32]。本研究发现，3个品种烤烟NtSS基因表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势，这与王红丽等[14]研究的NtSS基因表达量逐渐增强的规律有所不同，这是因为当烟叶由适熟至过熟的过程中，叶片内糖代谢底物逐渐减少，烟叶糖代谢减弱，相应的基因表达量下调；烟叶适熟时，K326叶片内NtSS基因表达量显著高于秦烟96和豫烟6号；NtSPS基因表达量波动较大，移栽后115 d其表达量显著上调；NtINV基因表达量呈单峰曲线变化，移栽后85 d达到峰值，这与牛德新等[15]研究结果一致。烟叶打顶后，3个品种烤烟糖代谢关键酶基因表达量均不同程度上调，说明烟叶进入成熟期糖代谢活动增强。秦烟96、豫烟6号和K326各基因表达量在不同成熟阶段存在一定差异，这可能与烤烟品种遗传特性和适应性有关。

综合分析烤烟成熟期打顶至适熟、适熟至过熟发育阶段糖代谢水溶性糖含量、酶活性及基因表达量之间关联性可知，烟叶打顶至适熟阶段，SPS、AI活性与各水溶性糖（蔗糖除外）含量之间相关性较强，而当烟叶适熟至过熟时，SPS活性与可溶性糖（蔗糖除外）含量之间相关性显著降低，说明烟叶打顶至适熟阶段SPS和AI活性对烟叶可溶性糖分积累有重要贡献，而当烟叶进入过熟阶段时，AI活性主要参与烟叶的糖代谢调控。烟叶适熟至过熟阶段，SS、SPS活性与蔗糖含量相关性较强，说明SS和SPS酶活性对烟叶蔗糖的积累起重要作用。烤烟成熟期不同阶段糖代谢相关基因与可溶性糖含量之间相关性波动较大，说明不同发育阶段调控烟叶糖代谢的主要物质不同。烟叶打顶至适熟阶段，NtINV对烟叶糖代谢调控作用较大，而烟叶适熟至过熟阶段，NtSS和NtSPS对烟叶糖代谢起主要的调控作用。综合分析烤烟成熟过程中水溶性糖含量、糖代谢关键酶活性及相关基因表达量之间的相关性发现，烟叶糖代谢关键酶活性与可溶性糖含量相关性明显高于相关基因与可溶性糖含量之间相关性，说明糖代谢关键酶直接参与烟叶糖代谢的调控，而糖代谢相关基因则是在分子层面对烟叶糖代谢进行调控。综上所述，烤烟成熟期经历了复杂的生理生化变化过程，糖类往往作为信号分子，与激素、氮等信号协同调节糖代谢与基因表达，由此进一步表明烟叶糖代谢的复杂性。

4 结 论

在烤烟成熟期，烟叶内葡萄糖、果糖、麥芽糖、还原糖和可溶性总糖含量总体呈先上升后下降的变化趋势，叶片成熟时其含量达到峰值；成熟期蔗糖含量呈双峰波动变化，烟叶成熟时蔗糖含量较低。烤烟成熟期不同发育阶段烟叶糖代谢分子调控机制不同，烟叶打顶至适熟阶段，SPS和AI活性对烟叶中水溶性糖的积累贡献最大，NtINV对烟叶糖代谢起主要调控作用；烟叶适熟至过熟阶段，AI主要参与烟叶糖代谢活动，NtSS和NtSPS对烟叶糖代谢起主要调控作用。同一生态环境和栽培条件下，豫烟6号内含物质充实，具有较高的水溶性糖含量。本研究从分子生物学角度探究了不同品种烤烟成熟期糖代谢关键酶活性及基因表达的规律，为烟叶品质形成的分子作用机理奠定了理论基础。

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