徐以华 孙磊 王玲

摘要 水稻穗枯病是水稻生产上重要的细菌性病害，目前针对其病原菌快速高效分离的体系很少有报道。本文以水稻细菌性穗枯病菌Burkholderia glumae标准菌株LMG2196为研究对象，探讨分析了B.glumae的生长温度、培养基上的菌落形态及对抗生素敏感性等。结果表明，选用含50 μg/mL氨苄青霉素的KB平板划线，25℃培养36 h，可以快速高效分离B.glumae。B.glumae主要通过分泌毒黄素对寄主产生致病性，本文利用分光光度法测定了LMG2196菌株在不同温度以及营养条件下毒黄素的产生。LMG2196菌株在25～40℃之间均能产生毒黄素，在营养条件不同的LB和PPG液体培养基中，同一温度下，总体上表现为在PPG中产生的毒黄素要比LB中的多；且LB的最适产毒黄素温度是28～30℃，PPG的是37℃，表明毒黄素的产生与温度和营养条件有关。

关键词 水稻细菌性穗枯病； 病原菌； 快速高效分离； 毒黄素

中图分类号： S 435.111.49

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018039

Abstract Bacterial panicle blight is one of the destructive diseases on rice crop. However， there are few studies on rapid and efficient isolation of the pathogenBurkholderia glumae. Growth temperature， colony morphology and antibiotic resistance of standard strain ofB.glumae LMG2196 were investigated in this study. The results showed that LMG2196 was rapidly and effectively isolated on KB medium with the concentration of 50 μg/mL ampicillin cultured 36 h at 25℃. Furthermore， the effects of temperature and nutrition on the production of toxoflavin from LMG2196 were also studied by spectrometry detection. The results confirmed that LMG2196 could produce toxoflavin at the temperature from 25℃ to 40℃ in both LB and PPG liquid medium. The level of toxoflavin production in PPG was higher than in LB at the same temperature. The optimal toxoflavin-producing temperatures were 28℃ to 30℃in LB medium and 37℃in PPG medium. All the above results showed that the production of the toxoflavin was correlated to temperature and nutrition.

Key words bacterial panicle blight of rice； pathogenic bacteria； fast and efficient isolation； toxoflavin

水稻細菌性穗枯病（bacterial panicle blight of rice，BPBR）是由颖壳伯克氏菌Burkholderia glumae引起的一种细菌性病害。病原菌能产生毒黄素，毒害寄主植物。主要使水稻秧苗腐烂、谷粒以及叶鞘褐变[1-3]（故又被称水稻苗腐病、谷枯病和颖枯病）[4]，造成水稻减产，毒黄素还会严重影响稻米品质，危害人类以及其他动物的健康。

水稻细菌性穗枯病最先在日本报道，随后在亚洲、美洲、欧洲以及非洲等各水稻种植区暴发流行，给全世界的水稻生产造成严重威胁，已引起人们的高度重视[5]。该病在我国早期已有报道，简锦忠1984年在台湾省中南部的稻田发现穗枯病[6]；王昌家等2006年在黑龙江省佳木斯地区发现该病，且处于零星初发生阶段[7]；罗金燕等于2008年从2份浙江省稻种（来自海南的籼稻）上分离到了B.glumae，表明表面看似健康的稻种也可能带有穗枯病菌[8]。近年，根据本实验室调查（未发表的资料），全国北起黑龙江建三江南到海南三亚，西自四川东到台湾，稻田中均有发现水稻穗枯病发生、危害，个别稻区、年份发生面积大、危害严重。据2017年10月在广西容县罗江镇、石头镇等15个乡镇调查，‘犇优9901、‘晶两优华占、‘y两优1998、‘隆两优1988、‘隆两优黄莉占、‘隆两优534等全县大多数品种水稻穗枯病都有不同程度发生，发生面积约500 hm2，一般病穗率6.5%～20%，严重的30%～50%（实际调查结果，尚未发表）。因此，建立该病原菌的准确、快速、高效的分离体系尤为重要。PCR、real-time PCR、双重PCR等分子生物学技术在病原菌分离鉴定中应用越来越广泛[9-14]。但是，在运用分子生物学技术鉴定之前，通常由于杂菌太多，工作量大不容易分离到目标菌。为能够快速准确分离到B.glumae，本文对B.glumae的特定生长温度、菌落形态特点以及抗生素抗性进行了研究，优化了分离条件，建立了一套简单、快速、高效的分离方法。

毒黄素是B.glumae的关键致病因子，在致病过程中起主要作用。在分子水平上毒黄素的合成和转运分别由操纵子toxA、toxB、toxC、toxD、toxE、toxF、toxG、toxH和toxI负责，并依赖群体感应[15-17]。有研究指出，毒黄素的产生受温度调控。Matsuda报道，在25～28℃时，B.glumae不产生毒黄素，28℃以上才能检测到毒黄素的产生[18-19]。目前，有多种方法可以定性、定量分析毒黄素，主要包括薄层色谱法、分光光度法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法和生物传感测定法，其中分光光度法是最简便的方法。毒黄素于393 nm存在紫外吸收峰[20-22]，故用分光光度计测定OD393峰值大小即可反映毒黄素的产生量。本文通过分光光度法对B.glumae产毒黄素与温度以及培养基之间的关系进行了研究。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

B.glumae标准菌株LMG2196由浙江大学谢关林教授提供。

1.2 水稻细菌性穗枯病菌分离条件的优化

1.2.1 B.glumae的特定生长温度筛选

将 LMG2196接种到LB液体培养基（酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0）培养至108 cfu/mL菌液后，按1∶1 000接种至3 mL LB液体培养基中，分别置于16、25、28、30、35、37、40和45℃，200 r/min振荡培养48 h，每个温度处理设3个重复。用分光光度计（Unico 4802 UV/VIS，中国）测定各培养菌液在不同时间段（0、4、8、12、24、28、32、36和48 h）的OD600。

1.2.2 B.glumae形成典型菌落形态培养基筛选

分别制备NA（聚蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖15 g，琼脂17 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0）、KB（蛋白胨 20 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，甘油 15 mL，琼脂15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2）、LB（酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂16 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0）、PDA（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1 L）平板，用接种环划线接种LMG2196，37℃培养箱培养24 h，观察各平板上的菌落形态。

1.2.3 B.glumae对抗生素抗性筛选

将氨苄青霉素（ampicillin，Amp）、卡那霉素（kanamycin，Kan）、链霉素（streptomycin，Str）和利福平（rifampicin，Rif）分别加到融化并稍加冷却的NA培养基中，使抗生素在培养基中的浓度均为50 μg/mL，倒平板。取100 μL LMG2196菌液分别涂布到上述制备的抗生素平板，各3次重复，以不加抗生素的NA平板为对照，同时置37℃培养箱中培养48 h，观察 LMG2196抗生素抗性。

1.2.4 B.glumae分离条件筛选及优化条件验证

供筛选和验证的感病标样来自全国不同稻区（包括浙江富阳、萧山、宁波，福建南平、广东韶关，广西贵港、南宁、玉林、博白县、兴业县等，共30份样品），见图1，用70%乙醇对感病标样进行表面消毒15 s，无菌蒸馏水冲洗3遍，灭菌剪刀将病样剪碎，加入1 mL无菌蒸馏水浸泡10 min，接种环蘸取菌悬液，分别在不含Amp的 NA（Amp-）、含Amp NA（Amp+）、不含Amp 的KB、含Amp 的KB平板上划线，4个处理均分别置于25℃和40℃培养36 h后用全自动菌落计数器（Scan 1200，interscience，法国）计数，每处理重复3次。

RT-PCR鉴定分离菌。接种环划线后在上述筛选的条件下培养，挑取相同数目且菌落形态疑似穗枯病菌的单菌落进一步培养，分离、纯化，用B.glumae特异性引物glu1/glu2进行菌落PCR[11]。glu1：5′-CTCTGCAACTCGAGTGCATGAGC-3′；glu2：5′-CGGTTAGAC TAGCCACTTCTGGTAAA-3′，片段长度约139 bp。

1.3 影响B.glumae产毒黄素因素分析

1.3.1 温度及营养条件对B.glumae产毒黄素的影响

将浓度为108 cfu/mL菌液按1∶1 000分别接种至300 mL LB和PPG液体培养基（马铃薯 50 g，多胨10 g，甘油20 mL，NaCl 3 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0）[17]，置于不同温度的培养箱培养至相同的OD600，12 000 r/min离心2 min，转移上清至新的三角瓶，加入等体积的氯仿，充分混匀萃取，12 000 r/min 离心10 min，将氯仿层转移到新的容器，通过旋转仪蒸干所得提取物即为毒黄素[21-22， 24]，加入5 mL 80%甲醇溶解毒黄素，用分光光度计测量393 nm处的吸收值，分别以不接菌的空白LB和PPG为对照，每个处理3次重复。

1.3.2 平板法测定LMG2196产生的毒黄素

取20 μL LMG2196涂布在KB固体培养基上，置于各测定温度（25、28、30、35、37和40℃）下倒置培养48 h，观察平板上黄色色素（即毒黄素）的产生。

2 结果与分析

2.1 水稻細菌性穗枯病菌分离条件优化

2.1.1 B.glumae的特定生长温度

B.glumae的生长温度范围较宽，在25～40℃均能生长（图2～3），其最适生长温度在35～40℃之间，是一种适合在较高温度条件下生长的病原细菌。而一般的植物病原菌的最适生长范围在28℃左右，不耐高温且低温不利于生长，故可以选用25℃或40℃作为分离温度，这样会抑制一些低温不利其生长或不耐高温的细菌和真菌生长，减少杂菌。

2.1.2 B.glumae在不同培养基上的菌落形态

B.glumae LMG2196能在多种培养基上生长，在不同培养基上其生物学特性有差异。在KB、LB、NA、PDA上的菌落均呈圆形、隆起、灰白色，边缘光滑。在KB、LB、NA平板上生长较好，菌落相对较大（直径在0.70 mm左右），其中在KB平板上菌落密集处的培养基呈黄色；在NA上LMG2196菌落聚集区域培养基呈淡蓝色，对光观察更为明显；在LB上菌落聚集区域培养基颜色几乎无变化。LMG2196在PDA平板上生长较慢，菌落较小（直径为0.15～0.39 mm），培养基颜色几乎无变化（图4，表1）。因LB是细菌的通用培养基，也比较利于其他病原细菌的生长，故选用NA和KB培养基作为分离培养基，可以提高分离的准确性。

2.1.3 B.glumae对抗生素的敏感性

通过分析LMG2196对抗生素的敏感性，发现该菌对Kan、Str、Rif比较敏感，而对Amp有抗性，能够在含有Amp（工作浓度为50 μg/mL）的抗生素培养基中正常生长（表2），但很多植物病原菌（包括真菌和细菌）对Amp是敏感的，不能在含Amp培养基中生长。故在培养基中添加一定浓度的Amp，能进一步排除掉一些杂菌。

2.1.4 B.glumae分离条件筛选及验证

在不同温度、培养基以及抗生素条件下，接种环蘸取来源于感病样品（图1）的菌悬液划线的平板上菌落数差异较大（表3，图5）。40℃条件下，培养36 h，NA（Amp-）、NA（Amp+）、KB（Amp-）平板上菌落较多，且杂菌也多，有些菌落被长势快的杂菌覆盖，穗枯病菌形态的菌落较少；在KB（Amp+）平板上菌落总数较少，穗枯病菌形态的菌落也较少，故该条件不利于菌的生长。在25℃条件下，培养36 h，NA（Amp-）平板菌落总数及杂菌较多；NA（Amp+）、KB（Amp-）、KB（Amp+）平板上菌落数相似，但NA（Amp+）、KB（Amp-）杂菌落相对较多，只有KB（Amp+）平板上穗枯病菌形态的菌落最多且杂菌最少。故用含Amp的KB培养基在25℃条件下划线培养36 h，分离效果最好。

接种环蘸取病样菌悬液分别在KB（Amp+）和KB（Amp-）平板上划线，25℃培养36 h，挑取13个光滑凸起、灰白色的单菌落做RT-PCR检测分离菌。结果显示，不含Amp的KB培养基对B.glumae分离率为23.1%，含Amp的KB培养基的分离率为61.5%（图6），是优化前分离率的3倍左右，分离效率得到较大提高。故分离B.glumae时可选用含Amp的KB培养基，25℃培养36 h，挑取灰白色、光滑凸起的单菌落进行RT-PCR鉴定能更快速、准确地分离到B.glumae。

2.2 B.glumae產毒黄素与温度的关系

在B.glumae能正常生长的温度25、28、30、35、37、40℃条件下，B.glumae均能产生毒黄素。在菌体密度相同（OD600=3.5）条件下，不同温度下的B.glumae产生毒黄素的量存在差异，且在相对较低的温度25、28℃下也有毒黄素产生，与早期报道的低于28℃不产毒黄素[15]结果不一致，猜想早期研究中不产毒可能原因是B.glumae群体密度不同，群体感应影响了B.glumae毒黄素的产生[22]，其次可能是由于B.glumae的菌种不同，造成产毒黄素的能力不同。在相同温度下，培养至相同菌体密度的B.glumae在不同的培养基产毒黄素的量不同，LB作为细菌的通用培养基，在相对低温时易产毒黄素，28、30℃产毒黄素的量最多。PPG培养基作为B.glumae的产毒培养基更利于B.glumae产毒黄素，且在37℃产毒黄素最多（图7）。

2.3 平板测定LMG2196产生毒黄素

B.glumae在KB培养基上能产生呈黄色的毒黄素，可用肉眼观测到。LMG2196接种在KB平板上培养48 h后，各测定温度下包括25℃的KB平板上均能观测到毒黄素产生（图8），与液体培养基培养条件下结果一致。运用平板接菌培养虽然不能定量描述毒黄素产生，但能直观地呈现出毒黄素在不同温度下的产生情况，充分证明LMG2196在25℃下能产毒黄素。

3 讨论

本研究通过测定水稻细菌性穗枯病菌B.glumae标准菌株LMG2196在不同温度条件下的生长曲线，发现该菌在相对较低的温度25℃也可生长，但25℃却不利于其他病原细菌和真菌生长，故选择25℃作为水稻细菌性穗枯病样的分离温度可排除许多杂菌的干扰。另外，本研究首次证实B.glumae对氨苄青霉素（Amp）具有抗性。结合B.glumae在不同选择性培养基上的菌落形态特征、对抗生素的敏感性以及生长温度条件，建立了优化的B.glumae的分离方法：含50 μg/mL氨苄青霉素的KB培养基，25℃培养36 h。运用此优化的分离方法，可准确、快速、高效地从全国各地采取的感病标样中成功分离到穗枯病病原菌，证实穗枯病已经在我国发生，做好该病的防治准备刻不容缓。

毒黄素作为B.glumae的主要致病因子，其合成受多种因素影响，至今报道影响B.glumae产毒黄素的因素主要有温度和群体感应等[15， 22]。本文探究了温度以及营养条件对B.glumae产毒黄素的影响。发现只要B.glumae达到一定群体密度，在低于28℃下也能产生毒黄素。在相同的培养时间内，B.glumae在不同的培养基中培养其产生毒黄素的量不同，表明其产毒黄素的能力与营养条件有密切关系。B.glumae产生毒黄素是一个非常复杂的过程，受多种因素调控。探明B.glumae产生毒黄素的复杂途径，在实践中通过阻断B.glumae产毒黄素的任一途径，可作为靶点筛选防治药物，为今后防治该病害提供了新的思路。另外，有研究报道毒黄素具有抑菌、杀菌和抗肿瘤功效，掌握适宜产毒黄素的条件，为今后研究毒黄素在抑菌、杀菌和抗肿瘤方面的基础和应用研究提供可能。

此外，還发现LMG2196是一种较耐高温的细菌，在高达40℃培养条件下亦可生长。在当今全球变暖的情况下，B.glumae能在高温下生长的特性无疑会对水稻生产造成越来越严重的危害。目前，由B.glumae引起的水稻穗枯病在我们的邻国韩国、越南、日本大面积暴发流行，我国有着类似的环境，且在我国已有发生，对我国水稻生产也是一种威胁，需引起高度重视。

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（责任编辑：田 喆）