李芳玉，夏小婷，贾玉堂，党瑞华，陈 宏，雷初朝*

(1.西北农林科技大学动物科技系统，陕西 杨凌 712100；2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031)

中国黄牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛两个牛种，二者的共同祖先是原牛[1]。作为世界牛品种资源宝库的重要组成部分，我国地方黄牛品种具有丰富的遗传多样性。1986年，邱怀[2]在《中国牛品种志》将中国地方黄牛品种按照地理分布区域的不同，把中国黄牛分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛3大类。大别山牛以分布在大别山而定名，是南方黄牛代表品种之一，属于役肉兼用型牛。主要产区为湖北省大别山西部的黄陂﹑大悟﹑英山﹑罗田﹑红安﹑麻城和安徽省大别山东部的金寨﹑岳西﹑六安﹑舒城﹑桐城﹑潜山﹑太湖﹑宿松等县。大别山牛具有适应性好、抗病力强、耐粗饲等优点，对高温、高湿和寒冷具有较强的耐受性，经改良后杂交优势明显，是我国优良地方品种之一。 Y染色体由雄性特异区(MSY)和拟常染色体区(PAR)两部分组成，其中MSY区在减数分裂时不与X染色体发生重组，具有父系遗传特性，且Y染色体的单倍型完整，具有较低的突变率，不易受重组和回复突变等因素影响，是探明父系遗传多样性、起源和驯化历史等研究的理想工具[3]。利用位于Y染色体MSY区的单核苷酸多态性(Y-SNPs)和微卫星(Y-STRs)标记可以确定牛的Y染色体单倍型组(即普通牛Y1和Y2单倍型组，瘤牛Y3单倍型组)，对阐明家牛的遗传多样性、群体结构以及父系起源历史发挥了重要作用。根据以往的一些研究表明[1,4]，利用Y-SNPs可以区分Y1、Y2和Y3三种单倍型组，而利用Y-STRs可以更精细地区分每个单倍型组中丰富的单倍型。 常振华等[4]基于Y-SNPs标记(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)和 Y-STRs标记(INRA189和BM861)对16个中国地方黄牛品种284头公牛进行了父系遗传多样性及起源分析，结果在16个黄牛品种中仅发现普通牛Y2和瘤牛Y3单倍型组，未检测到普通牛Y1单倍型组，得出结论为中国黄牛存在普通牛Y2和瘤牛Y3两种父系起源，普通牛在北方占优势，瘤牛主要分布在南方，中原地区为二者交汇处。但是其研究并未涉及到大别山牛。本研究利用2个Y-SNPs标记UTY-19和ZFY-10及2个Y-STRs标记INRA189和BM861对49头大别山牛公牛进行多态性检测，通过分析大别山牛Y染色体的单倍型组成，来探明该品种的遗传多样性、群体遗传结构及父系起源。

1 材料与方法

1.1 采样及基因组DNA提取

在安徽省太湖县大别山牛保种场采集大别山牛公牛的耳组织低温保存带回实验室，常规酚-氯仿法提取基因组DNA，稀释浓度至10～20 ng/μL，保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照Götherström等[5]和Ginja等[6]报道的2个家牛Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)以及Edwards等[7]的研究中的Y-STRs标记(INRA189和BM861)合成四对引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 家牛2个Y-SNPs位点及2个Y-STRs位点的名称、位置、退火温度与引物序列

25 μL PCR体系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海宝生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超纯水12.5 μL。PCR反应程序：98℃变性10 s，X℃(表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35个循环，后冷却至4℃保存。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶(含 GoldView 核酸染料)电泳后，凝胶成像系统拍照检测。

1.3 测序、单倍型组分型及单倍型频率计算

将Y-SNPs标记的PCR纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA测序仪(Applied Biosystems公司)进行正、反向测序，测序结果用Chromas 2.3软件进行查看和校正，得到每头大别山牛公牛的2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)测序序列。2个Y-STRs标记的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行荧光分型，获得INRA189和BM861的等位基因大小。根据Y-SNPs标记和Y-STRs标记的数据联合分析，获得大别山牛公牛的单倍型，再用Arlequin 3.0软件进行单倍型多样度计算。

2 结果与分析

通过对49头大别山牛公牛的2个Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)标记的测序分析以及参考Götherström等[5]和Ginja等[6]对家牛Y染色体单倍型组的判定标准，结果表明：这2个Y-SNPs标记在49头大别山牛中均没有多态性，与Götherström等[5]对家牛Y1、Y2、Y3单倍型组的判定标准相比，其中UTY-19标记发现一个对应的A 碱基，在ZFY-10标记发现1个对应的T碱基和1个GT插入/缺失，表明49头大别山牛只包含Y3一种单倍型组(表2)。对49头大别山牛公牛的2个Y-STRs(INRA189和BM861)标记进行多态性分析，结果显示，INRA189只有一个等位基因，大小为88 bp，而BM861也只有一个大小为156 bp的等位基因。〗结合Y-SNPs和Y-STRs标记确定大别山牛的单倍型为Y3-88-156(表2)，说明大别山牛只有一个瘤牛父系起源。大别山牛的单倍型多样度为0，说明其父系遗传多样性很低，遗传基础非常稳定。

表2 大别山牛的Y染色体单倍型

3 讨论

利用Y-SNPs标记可以判断家牛的Y1、Y2和Y3单倍型组，而Y-STRs标记可以反映黄牛3种单倍型组内丰富的Y染色体单倍型与遗传多样性。将Y-SNPs与Y-STRs分子标记结合使用可以完整地反映Y染色体单倍型结构，这种方法目前已经广泛用于家牛的遗传多样性和父系起源研究[3]。Edwards等[7]利用Y-SNPs与Y-STRs方法研究了世界范围的138个牛品种，分析了不同品种Y染色体单倍型的地理分布情况，发现欧洲牛只拥有普通牛单倍型组，而瘤牛单倍型组主要分布在亚洲西南部。Li等[8]对16个中国地方黄牛品种共302头黄牛公牛的4个Y-SNPs标记(DDX3Y-7、ZFY-9、ZFY-10和UTY-19)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)进行了多态性分析，与常振华等[4]的结论一致，但是却发现有些个体含有Y1单倍型组，推测在中国黄牛中低频率的Y1单倍型组可能是由于外来牛品种的雄性渗入的原因[8]。赵晓诚等[9]利用Y-SNPs标记分析陕西岭南牛的遗传多样性，发现岭南牛属于南方黄牛类型，有普通牛Y2和瘤牛Y3 两个父系起源，尤以瘤牛起源为主。

本研究中，利用Y-SNPs与Y-STRs分子标记相结合的方法对大别山牛的Y染色体多态性进行研究，分析其遗传多样性及父系起源。利用Y-SNPs标记确定大别山牛只有一个Y3单倍型组，利用Y-STRs标记的等位基因大小确定了大别山牛Y3单倍型组中详细的单倍型，结果显示49头大别山牛全部为Y3-88-156单倍型，单倍型频率为1，说明大别山牛只有一个瘤牛父系起源。Jia等[10]利用mtDNA D-loop序列研究六个亚洲国家家牛的母系起源，其中对3头大别山牛进行研究，发现3头大别山牛均为瘤牛I1支系，结合本文研究结果，说明从父系和母系角度都支持大别山牛为瘤牛起源。

单倍型多样度是衡量一个群体变异程度的重要指标。Li等[8]对16个中国地方黄牛品种共302头黄牛公牛的父系遗传多样度表明，各个品种的平均单倍型多样度值为0.683±0.013；而本研究中大别山牛的单倍型频率为1，单倍型多样度为0，说明大别山牛的父系遗传多样性很低，父系遗传单一，品种很纯。由于大别山牛所处地理位置较为偏僻，与外界基因交流少，牛群多为封闭性选育和小群饲养，公牛有效群体较小等原因导致其遗传多样性很低。因此，应该树立正确的品种资源保护意识，建立健全大别山牛保种体系，从而使这一优良种质资源得到有效保护和利用。

参考文献:

[1] 常振华, 黄洁萍, 徐苹,等. 中国黄牛Y-STRs遗传多样性与起源研究[J]. 中国牛业科学, 2012, 38(3): 9-13.

[2] 邱怀. 中国牛品种志[M]. 上海：上海科学技术出版社,1986.

[3] 李冉, 常振华, 徐苹, 等. 黄牛Y染色体分子遗传多样性研究进展[J].中国牛业科学, 2012, 38(04): 43-47.

[4] 常振华, 卫利选, 张润锋,等. 中国黄牛Y-SNPs遗传多样性与起源研究[J].畜牧兽医学报, 2011, 42(11):1537-1542.

[5] Götherström A, Anderung C, Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J]. Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences, 2005, 272: 2345-2351.

[6] Ginja C, Da Gama LT, Telo da Gama L, et al. Y chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J]. Journal of Heredity, 2009, 100(2):148-157.

[7] Edwards CJ, Ginja C, Kantanen J, et al. Dual origins of dairy cattle farming-Evidence from acomprehensive survey of Europea Y-chromosomal variation [J]. PLoS One, 2011,6:el5922.

[8] Li R, Zhang XM, Campana MG, et al. Paternal origins of Chinese cattle[J].Animal Genetics, 2013, 44(4):446-449.

[9] 赵晓诚，林清，左自意，等. 岭南黄牛Y-SNP遗传多样性与父系起源研究[J].中国牛业科学，2017, 43(4): 4-6.

[10] Jia S, Zhou Y, Lei C, et al. A new insight into cattle's maternal origin in six Asian countries[J].Journal of Genetics and Genomics, 2010,37(3):173-180.