胡桂羽, 王曼曼, 念琪循, 李 娜, 董鑫鑫, 郝玉兰, 王 茜, 王学生(华北理工大学公共卫生学院, 河北 唐山 063000)

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物,是一类持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)。PAHs具有“三致”毒性(致畸、致癌、致突变),欧盟、美国、中国等都将其列为环境优先控制污染物。因此,准确评价PAHs的人体暴露水平,对于环境健康风险评价及毒理学研究具有重要意义[1,2]。

PAHs通常分布在空气、水体、土壤、食物、烟草烟雾等介质中,可经呼吸系统、消化系统、皮肤接触等途径进入人体,经代谢转化为羟基多环芳烃(OH-PAHs),并以葡萄糖醛酸盐和磺酸盐的形式由尿液排出[3-7]。因此,国内外常以尿液中的OH-PAHs作为生物标志物来综合评价PAHs的人体暴露水平[8]。常见的OH-PAHs有2-羟基芴(2-FLU)、1-羟基菲(1-OHPe)、3-羟基菲(3-OHPe)和1-羟基芘(1-OHP),其结构式见图1。

图 1 4种OH-PAHs的结构式Fig. 1 Chemical structures of the four hydroxyl polycyclic aromatic hydrocarbons (OH-PAHs)

目前主要采用色谱法分析尿液中的OH-PAHs[1,8-11],但是尿液中待测组分的含量较低,难以检出,且尿液成分复杂,杂质干扰严重,因此在仪器分析前需对样品中的待测物进行富集和净化。尿液中OH-PAHs的前处理方法有液液萃取法(LLE)[12-14]和固相萃取法(SPE)[8]。液液萃取法需要消耗大量的有机溶剂且萃取效率有限;固相萃取法因具有萃取效率高、有机溶剂消耗少的特点而被广泛应用,但是目前商品化C18萃取柱往往是一次性的,使用成本较高。

吸附剂是固相萃取技术的核心,不仅决定了方法的准确度,还影响方法的分析时间和成本。聚合物整体柱作为一种应用广泛的吸附分离材料,通常是通过反应试剂原位聚合而得到的棒状整体,由于具有结构多孔、比表面积大、生物兼容性好等优点,已成功用于生物医学、环境科学、食品卫生等领域的样品前处理中[15-17]。本课题组建立了以甲基丙烯酸丁酯为单体的在线净化柱,结合液相色谱-质谱法,分析测定了食品中阿维菌素残留[18]。

本实验在注射器空管中构筑甲基丙烯酸丁酯吸附剂,得到的固相萃取柱用于净化富集尿液中的OH-PAHs,结合高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD),建立了一种简单、经济的测定尿液中4种OH-PAHs的方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 1200型高效液相色谱-荧光检测器(美国Agilent公司); HSC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司); Milli-Q水纯化系统(美国Millipore公司)。

甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate, BMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate, EDMA)购自上海阿拉丁试剂公司;正丙醇、聚乙二醇、偶氮二异丁腈购自天津市光复精细化工研究所;β-葡萄糖醛酸酶水溶液(Type HP-2)、甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)(色谱纯)均购自美国Sigma-Aldrich公司。丙酮、乙酸乙酯、磷酸二氢钠、乙酸钠和醋酸均为国产分析纯。

2-FLU(纯度98.0%)购自上海阿拉丁试剂公司;1-OHPe(纯度98.0%)、3-OHPe(纯度98.0%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;1-OHP(纯度98.0%)购自美国Sigma-Aldrich公司。

用MeOH配制待测物的标准储备液,质量浓度为2 μg/mL,于4 ℃避光保存;用水稀释上述标准储备液,配制成质量浓度为25 ng/mL的标准工作液,于4 ℃避光保存,待用。

1.2 整体柱的制备

参照课题组报道的方法在固相萃取模具中合成聚合物整体柱[18]。准确量取单体BMA 160 μL、交联剂EDMA 565 μL、丙醇1 000 μL和聚乙二醇875 μL(均为致孔剂),加入引发剂偶氮二异丁腈10 mg,于室温下超声混合、脱气,取500 μL上述混合液灌入2 mL注射器空柱管中,将两端密封后于60 ℃水浴反应24 h。反应完成后用甲醇冲洗未反应的单体及致孔剂,得到聚(甲基丙烯酸丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(poly(BMA-co-EDMA))固相萃取柱。

1.3 尿液样品的制备

收集:在8 h工作制下,对连续工作3天的河北省某地焦炉工人收集晨尿,于-20 ℃冷冻保存。

将尿液样品解冻,混匀,取5.0 mL置于离心管中,加入10 μLβ-葡萄糖醛酸酶、5.0 mL醋酸钠缓冲溶液(pH 5),于37 ℃避光水解过夜。将水解后的尿液样品以1 500 r/min离心10 min,取上清液于4 ℃储存待用。

1.4 固相萃取

依次用2 mL ACN和水平衡poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱,然后将3 mL酶解后的尿液样品上样至萃取柱,用3 mL 25 mmol/L磷酸二氢钠溶液进行淋洗,最后以2 mL ACN为洗脱液进行洗脱,收集洗脱液,于37 ℃氮吹至干,用甲醇定容至0.25 mL。

1.5 分析条件

色谱柱为Supelcosil LC-PAH柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美国Supelco公司);流动相为(A)水和(B)ACN;流速为1 mL/min。梯度洗脱程序:0～6.5 min, 50%B; 6.5～9.0 min, 50%B～55%B; 9.0～20.0 min, 55%B。进样体积为20 μL。

4种OH-PAHs的激发波长(λx)和发射波长(λm): 2-Flu, 266 nm/366 nm; 3-OHPe, 250 nm/358 nm; 1-OHPe, 284 nm/383 nm; 1-OHP, 242 nm/396 nm。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的优化

通常尿液中OH-PAHs的前处理主要采用C18固相萃取柱,但由于OH-PAHs是一类非极性化合物,本实验采用的poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱,其聚合物骨架表面的丁基具有疏水性,可用于固相萃取尿液中的OH-PAHs。为了获得最佳的萃取效率,实验考察了上样浓度、淋洗液、洗脱液和洗脱体积对萃取效率的影响。

2.1.1上样浓度

实验考察了上样浓度对萃取效率的影响(见图2a)。分别以2、10、20和40 ng/mL的加标尿样为考察对象,按照1.4节操作进行前处理。结果表明,当质量浓度为2～40 ng/mL时,4种OH-PAHs的萃取效率为71.0%～103.9%,随着OH-PAHs质量浓度的增加(10～40 ng/mL),萃取效率无显著变化。说明固相萃取柱对OH-PAHs具有令人满意的吸附能力,且表现出良好的萃取容量。

图 2 (a)上样浓度、(b)淋洗液、(c)洗脱液和(d)洗脱体积对4种OH-PAHs萃取效率的影响(n=3)Fig. 2 Effects of (a) loading concentration, (b) washing solvent, (c) eluent and elution volume (d) on the recoveries of the four OH-PAHs (n=3)

2.1.2淋洗液

上样后目标化合物和部分杂质同时保留在固相萃取柱上,而必要的洗涤步骤可以将干扰化合物去除,使分析物仍保留在萃取柱上,因此淋洗液的选择至关重要。对3 mL 25 ng/mL的加标尿液样品进行分析,固定淋洗液体积为3.0 mL,分别使用MeOH-水(20∶80, v/v)、25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L磷酸二氢钠进行淋洗,2 mL ACN洗脱。如图2b所示,当采用25 mmol/L磷酸二氢钠溶液为淋洗液时,4种OH-PAHs的整体回收率最高,故选为实验所用。

2.1.3洗脱液和洗脱体积

洗脱液也是影响萃取效率的重要参数。考虑到分析物的溶解度,考察了MeOH、ACN、丙酮和乙酸乙酯作为洗脱液时4种OH-PAHs的回收率。对3 mL 25 ng/mL的加标尿样进行分析,用3 mL 25 mmol/L的磷酸二氢钠溶液淋洗,固定洗脱液体积为2 mL,分别使用上述4种不同洗脱液进行洗脱。结果如图2c所示,ACN的洗脱效果最佳,选为实验所用。

实验同时考察了洗脱体积(1、2和3 mL)对萃取效果的影响(见图2d)。结果表明,洗脱体积从1 mL增加到2 mL时,洗脱效率增加;继续增加洗脱体积,洗脱效率无明显变化,但是大量的洗脱液容易在氮吹、浓缩步骤中导致分析物的损失和时间的增长。因此最终选择2 mL ACN进行洗脱。

在最优条件下,结合HPLC-FLD,分别对0.3 ng/mL的加标尿液样品进行直接进样和固相萃取。结果表明,与OH-PAHs标准溶液的色谱图(见图3a)相比,直接进样时未检出OH-PAHs,且杂质峰明显(见图3b);经固相萃取后,OH-PAHs得到富集,可以看到明显的色谱峰,且杂质峰明显降低(见图3c),说明该方法能够有效去除尿液中的杂质,富集OH-PAHs。当上样体积为3 mL时,固相萃取柱对OH-PAHs的富集倍数为6。

图 3 (a)标准溶液和(b)直接进样、(c)经固相萃取后的加标尿液样品中4种OH-PAHs(0.3 ng/mL)的色谱图Fig. 3 Chromatograms of the four OH-PAHs (0.3 ng/mL) in (a) a standard solution and spiked urine samples by (b) direct sampling and (c) SPE

2.2 标准曲线、检出限和精密度

对质量浓度为1.2～200.0 ng/mL的OH-PAHs标准溶液进行分析,对OH-PAHs的峰面积(y)和质量浓度(x, ng/mL)进行线性回归,建立标准曲线。结果表明,4种OH-PAHs均表现出良好的线性关系,相关系数(r)为0.999 1～0.999 7(见表1)。

在空白尿液中添加不同质量浓度的待测物,计算方法的检出限(LODs,S/N=3)和定量限(LOQs,S/N=10),分别为0.06～0.09 ng/mL和0.20～0.30 ng/mL(见表1)。 对同一尿液样品进行分析,以日内(n=5)和日间(n=3)重复测定得到的色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)计算精密度,日内RSD和日间RSD分别为1.4%～5.3%和2.6%～7.3%。结果表明本方法具有良好的灵敏度和重现性。

表14种OH-PAHs的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量限和精密度

Table1Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs and precisions of the four OH-PAHs

OH⁃PAHLinearrange/(ng/mL)RegressionequationrLOD/(ng/mL)LOQ/(ng/mL)RSDs/%Intra⁃day(n=5)Inter⁃day(n=3)2⁃Flu1．2-200y=7314．8x+0．02080．99970．090．303．15．63⁃OHPe1．2-200y=5301．1x+0．55790．99970．080．255．36．21⁃OHPe1．2-200y=6321．6x+3．93180．99940．060．204．77．31⁃OHP2．4-200y=4097．4x-10．1050．99910．060．201．42．6

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

2.3 稳定性

采用同一批次(n=5)和不同批次(n=4)合成的固相萃取柱对加标尿液样品进行固相萃取。结果显示,使用同一批次和不同批次制备的固相萃取柱对4种OH-PAHs进行萃取，得到的色谱图无明显差异,峰形良好且响应值稳定,色谱峰面积的RSD分别为2.3%～5.6%和2.9%～7.9%。同时,使用3根萃取柱分别进行10次重复萃取,发现萃取效率没有明显下降(RSD≤3.6%)。

表 2 焦炉工人尿液样品中4种OH-PAHs的含量Table 2 Contents of the four OH-PAHs in urine samples of coke oven workers

N.D.: not detected.

2.4 实际样品分析

在最优实验条件下,对4名焦炉工人的尿液样品进行分析,结果见表2。在4个样品中均有2-Flu、3-OHPe和1-OHP的检出,质量浓度为1.0～9.5 ng/mL。

为进一步说明方法的可行性,对4份实际样品进行加标回收试验,加标水平为3 ng/mL,加标回收率为78.2%～117.0%,方法准确度令人满意。

2.5 与文献方法对比

将实验结果与文献方法进行对比(见表3),与液液萃取法或基于商品化的C18固相萃取法相比,本方法灵敏、准确。

表 3 本方法与文献方法的对比Table 3 Comparison of the present method with previously reported methods

LLE: liquid-liquid extraction; poly(BMA-co-EDMA): poly(butyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) monolithic column.

3 结论

本研究采用基于poly(BMA-co-EDMA)整体柱的固相萃取法,结合HPLC-FLD分析了尿液中4种OH-PAHs。该方法的灵敏度和精密度良好,同时萃取柱具有良好的稳定性,相比于传统的商品化固相萃取柱,该柱能够反复使用,节约成本。该方法可用于复杂样品中非极性物质的分析。

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