张馨月，田万年

（吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101）

在动物肌细胞中肌动蛋白占总蛋白的10%，是肌细胞中最丰富的蛋白质［1］。肌动蛋白由375个氨基酸残基组成，蛋白分子量为43 kDa，具有1个高度保守的基因编码。骨骼肌α-肌动蛋白1（actin alpha 1，ACTA1）主要参与骨骼肌纤维的发育，在骨骼肌的活动中发挥重要作用［2］。 Shin 等［3］研究发现，ACTA1基因在韩牛高、低大理石花纹等级牛肉中差异表达，提示该基因可能是参与脂肪沉积的重要基因之一。Lee等［4］研究表明，ACTA1基因在不同月龄的韩牛背最长肌中差异表达，说明该基因可能是参与调控牛肉质性状的重要基因之一。为了深入探讨牛ACTA1基因的生物学功能，该研究采用RT-PCR技术对延边黄牛ACTA1基因进行了克隆，利用生物信息学方法对其结构进行预测和分析，同时构建系统发育进化树，以期为深入研究该基因的理化性质及相关生物学功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

延边黄牛由吉林省珲春市某牧场提供。屠宰后采取背最长肌，一部分置于液氮中速冻，-70℃保存。

1.2 总RNA的提取及cDNA合成

采集牛背最长肌样本，按Trizol提取说明书提取总RNA，用紫外分光光度计检测RNA提取量和纯度，使其A260/A280在1.8～2.0。用反转录试剂盒对提取的总RNA进行反转录。cDNA总反应体系为：M-MLV 反转录酶 1 μL、Oligo（dT15）2 μL、dNTP （2.5 mmol/L）1 μL、10 ×buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、RNA 2 μg。

1.3 引物的设计与PCR扩增

根据已发表的牛ACTA1基因序列设计1对引物，上游引物序列为：5′-ATGTGTGACGAAGACGAGACCA-3′， 下游引物序列为：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACG-3′，目的扩增片段大小为1 134 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化PCR产物，送至上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

1.4 ACTA1基因的生物信息学分析

将牛ACTA1基因测序结果进行拼接。采用在线软件SignalP Server预测其信号肽；采用DNAMAN软件分析其编码蛋白质的理化性质并构建系统发育进化树；利用在线软件Prosite对其编码蛋白质的功能进行预测；利用NCBI的CDD数据库进行编码蛋白质保守区域的预测。

2 结果与分析

2.1 牛ACTA1基因的克隆和序列分析

以牛背最长肌提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物大小为1 134 bp（见图1）。扩增产物回收纯化后进行序列测定，测得的延边黄牛ACTA1基因与GenBank中牛NM_174225序列相似性为99.9%。

图1 牛ACTA1基因PCR扩增结果

2.2 牛ACTA1基因生物信息学分析

采用DNAMAN软件对延边黄牛ACTA1基因编码的蛋白质进行预测分析。结果表明，该基因编码的蛋白质分子质量约为42.12 kDa，等电点为5.16，为酸性蛋白质；利用CLUATAL W比对表明，牛ACTA1蛋白的氨基酸序列与猪 （GenBank accession no.：XP-003121682）、鸡 （GenBank accession no.：NP-001026400）、 犬 （GenBank accession no.：XP-838060）、小鼠 （GenBank accession no.：BAE40656）、黑猩 猩（GenBank accession no.：XP-002831777） 和 人 （GenBank accession no.：BAF83305）的氨基酸序列的相似性为99%。

采用在线软件ORF Finder分析，该基因的最大开放阅读框为1 134 bp，编码了377个氨基酸。经在线软件SignalP Server分析，该蛋白无信号肽序列，为非分泌性蛋白。Prosite分析显示，ACTA1蛋白可能存在1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，8个豆蔻酰化位点，2个酪氨酸激酶磷酸化位点，5个蛋白激酶C磷酸化位点。经过BlastP分析表明，该蛋白质序列存在1个ACTIN保守的结构域（见图2）。

图2 牛ACTA1蛋白保守结构域

图3 基于ACTA1基因构建的系统发育进化树

利用GenBank数据库已收录的ACTA1基因序列：小鼠（Mus musculus，GenBank accession no.：AK027919）、 褐家鼠 （Rattus norvegicus，GenBank accession no.：FQ215809）、 野猪 （Sus scrofa，Gen-Bank accession no.：NM001167795）、犬 （Canis familiaris，GenBank accession no.：XM-843847）、猩猩（Pongo abelii，GenBank accession no.：NM-001132414）、人（Homo sapiens，GenBank accession no.：BC012597）构建系统进化树，结果见图3。由图3可知，牛ACTA1基因（A4-Cattle）单独处于一分支，人和猩猩处于一分支，鼠和人的亲缘关系较近。

3 讨论

目前，对ACTA1基因的研究主要集中在该基因突变与人骨骼肌先天性疾病和横纹肌疾病的相关性方面，但其具体功能研究较少［5-8］。研究表明，蛋白质结构决定其功能特性，从而影响生命活动。该研究结果显示，牛ACTA1基因的CDS序列全长1 134 bp，编码377个氨基酸，该蛋白无信号肽序列，为非分泌性蛋白。应用生物信息学方法对其序列及编码的蛋白质进行分析和预测，结果表明，ACTA1蛋白可能存在1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，8个豆蔻酰化位点，2个酪氨酸激酶磷酸化位点，5个蛋白激酶C磷酸化位点。经过BlastP分析表明，该蛋白质序列存在1个ACTIN保守的结构域。

系统进化分析表明，牛ACTA1基因单独处于一个进化分支，而人和猩猩处于一个进化分支，亲缘关系较近，整个关系与真实物种间进化顺序相符。对不同物种的ACTA1蛋白序列进行比对，结果表明，牛ACTA1蛋白的氨基酸序列与人、小鼠、猪和犬的氨基酸相似性为99%，进一步说明ACTA1比较保守。该研究对牛ACTA1基因的理化性质及其编码蛋白的结构功能进行了预测，为进一步揭示该基因参与牛肉质性状调控的分子机制提供了理论基础。

参考文献：

［1］贺淹才.肌动蛋白和肌动蛋白基因的研究进展［J］.生命的化学，2002，22（3）：248-250.

［2］胡倩，曹允考，佟慧丽，等.牛骨骼肌基因α-actin基因5′上游调控元件及内含子功能的初步分析［J］.中国兽医学报，2015，35（7）：1136-1142.

［3］SHIN S C，CHUNG E R.Identification of differentially expressed genes between high and low marbling score grades of the longissimus lumborum muscle in Hanwoo（Korean cattle） ［J］.Meat Science，2016，121 （5）：114-118.

［4］LEE S H，PARK E W，CHO Y M，et al.Identification of differentially expressed genes related to intramuscular fat development in the early and late fattening stages of Hanwoo steers ［J］.Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2007，40（5）：757-764.

［5］LAING N G，DYE D E，WALLGREN-PETTERSSON C，et al.Mutations and polymorphisms of the skeletal muscle alpha-actin gene（ACTA1）［J］.Human Mutation，2009，30（9）：1267-1277.

［6］CLARKE N F，ILKOVSKIL B，NORTH K，et al.The pathogenesis of ACTA1 related congenital fiber type disproportion［J］.Annals of Neurology，2007，61（6）：552-561.

［7］JURETIC N，URZUA U，RIVEROS N，et al.Differential gene expression in skeletal muscle cells after membrane depolarization ［J］.Journal of Cellular Physiology，2007，210（3）：819-830.

［8］FENG J J，MARSTON S.Genotype phenotype correlations in ACTA1 mutations that cause eongenital myopathies［J］.Neuromuscular Disorders，2009，19（1）：6-16.