耿飞飞 于洪贤 刘曼红 孟瑶

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

摇蚊幼虫为完全变态类昆虫，是一种分布广泛且种类数量众多的底栖动物，具有解毒能力低、对污染物的暴露敏感、生活周期短等特性，且在实验室内易饲养，是水体质量监测中的重要指示生物。在加强水生态毒理学应用研究中，摇蚊幼虫被广泛应用于毒性测试[1-2]。依据摇蚊幼虫对水体中重金属的敏感性，开展了重金属对摇蚊幼虫的急性和慢性毒性实验[3]。相关研究有，Cu2+、Cd2+对红裸须摇蚊(Propsilocerusakamusi)幼虫和羽摇蚊(Chironomusplumosus)幼虫的急性毒性效应及对过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性的影响[4-5]等。Hg2+是存在于水环境中极具毒性的重金属，其毒性涉及到氧化应激，即Hg2+可诱导自由基的形成，并改变了细胞的抗氧化能力[6-8]，暴露于含有Cd和Cu的沉积物，对伸展摇蚊(Chironomustentans)幼虫具有致畸作用[9]。

关于生物体内重要解毒酶，我国近年来也开展了一些工作，研究的污染物涉及重金属、有机物污染物和工业废水。基于这些特性，摇蚊幼虫作为水生态系统食物链的关键环节，其体内抗氧化酶的活性或表达量与重金属Hg浓度之间的效应关系，可作为监测环境污染的一项灵敏指标。抗氧化酶系被用作指示环境污染的早期预警，从而成为分子毒理学生物标志物研究的热点之一[10-12]。然而，摇蚊幼虫在Hg2+的胁迫下，生物体内重要的抗氧化酶，如CAT、过氧化物酶(POD)、SOD、谷丙转氨酶(GST)的活性如何，还需要进行科学验证。

红裸须摇蚊是摇蚊中的优势种，广泛分布于我国的淡水环境中，在水生态系统食物链中占有重要的地位。本研究以红裸须摇蚊幼虫为实验材料，研究4种生物指标(CAT、POD、SOD、GST)在汞暴露下的变化规律，目的是探究汞对红裸须摇蚊幼虫抗氧化系统的效应，同时用以评估红裸须摇蚊幼虫对汞胁迫的敏感性，为将红裸须摇蚊幼虫重金属污染的生物监测提供参考。

1 材料与方法

实验用红裸须摇蚊购于哈尔滨市哈平路花鸟鱼虫市场，在实验室蒸馏水环境下，饥饿处理24h，挑选活性好、大小一致的4龄幼虫用于试验。试验用水为蒸馏水，每日投喂颗粒金鱼料作为摇蚊幼虫食物，水温(21.0±0.5)℃、pH为7.0±0.5，室内自然光下进行。试验用的Hg2+用分析纯HgCl2(质量分数为99.5%，姜堰市环球试剂厂)配置；用蒸馏水将HgCl2配成一定质量浓度的母液，再以蒸馏水稀释成所需质量浓度的实验溶液。蛋白质、CAT、POD、SOD的测定，利用相应的试剂盒(南京建成生物工程研究所)完成。采用SPSS17.0软件计算半数效应质量浓度(ch)及95%置信区间。

利用净水染毒法试验。通过预试验，根据寇氏改良法得到红裸须摇蚊幼虫的48 h半致死质量浓度(cs)为3.61 mg/L。将HgCl2用蒸馏水设置成质量浓度为0(对照组)、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg/L的处理组，每组设置3个平行样。将用于试验的红裸须摇蚊幼虫放入500 mL带有Hg2+的烧杯中，每个烧杯放50个，6、24、48、72 h取活性较好的摇蚊幼虫置于冰箱中-20 ℃保存，用作蛋白质、CAT、POD、SOD的测定。

采用SPSS16.0统计软件对试验数据进行分析。在同一时间段、不同质量浓度Hg2+对酶活性的影响，用SPSS软件的单因素方差分析进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 Hg2+对红裸须摇蚊幼虫CAT活性的影响

用不同质量浓度的HgCl2(0、1.6、2.4、3.6、5.4、8.1 mg/L)，分别处理红裸须摇蚊4龄幼虫6、24、48、72 h。6 h其体内CAT活性，在不同处理组表现为：随着汞质量浓度的增大，对酶的活性影响是先增加后减少的变化趋势，在5.4 mg/L时被显著诱导，达到最大值(0.233±0.002)U/mg；在8.1 mg/L时开始下降，为(0.039±0.025)U/mg。除了质量浓度8.1 mg/L，其它的质量浓度随着毒物作用时间的延长，在24 h被显著诱导，表现出最大的酶活性，然后在48 h以后酶的活性被抑制，即出现不同程度的下降。处理组8.1 mg/L在作用时间48 h，CAT活性最大，为(0.271±0.016)U/mg，在Hg2+作用72 h每个处理组的CAT活性被抑制，都呈现下降趋势(见表1)。同一时间不同质量浓度的Hg2+处理，对CAT活性影响的LSD法多重比较检验结果显示，48 h与72 h的各质量浓度Hg2+对CAT活性都没有明显差异，仅在24 h时SOD活性在对照组与其他质量浓度处理组之间的差异达到了显著性水平(p<0.05)(见表1)。

表1 Hg2+处理后红裸须摇蚊幼虫的CAT活性

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.2 Hg2+对红裸须摇蚊幼虫POD活性的影响

在Hg2+胁迫下，不同处理组的红裸须摇蚊幼虫体内POD的活性，在24 h时被诱导，在(0.615±0.020)～(0.683±0.028)U/mg之间，随着处理时间的延长有增加的趋势。同一时间不同处理组，对POD活性影响的LSD法多重比较检验结果显示，各时间段，各质量浓度Hg2+的POD活性与对照组相比变化不显著(p>0.05)。说明POD在受到Hg2+胁迫时，不同处理时间和不同处理组的红裸须摇蚊幼虫体内POD活性，没有明显的剂量-效应关系，表现相对复杂的变化(见表2)。

表2 Hg2+处理后红裸须摇蚊幼虫的POD活性

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.3 Hg2+对红裸须摇蚊幼虫体内SOD活性的影响

由表3可见：Hg2+胁迫下，不同的处理组红裸须摇蚊幼虫体内SOD酶的活性，高质量浓度的处理组(5.4、8.1 mg/L)，在长的暴露时间(48、72 h)，SOD的活性都较高，在72 h都达到最大值，并且5.4 mg/L处理组最大，为(0.922±0.055)U/mg。不同处理组，如1.6、2.4、3.6 mg/L处理组，在48 h的SOD酶活力较低些，为(0.333±0.062)～(0.814±0.065)U/mg；5.4 mg/L处理组，随着作用时间的延长，在24 h时SOD酶活力降低，为(0.420±0.086)U/mg；8.1 mg/L处理组，在暴露6、24 h，红裸须摇蚊幼虫体内SOD酶活力均稍低于对照组。同一时间不同质量浓度的Hg2+处理，对SOD活性影响的LSD法多重比较检验结果显示，24、48 h的各质量浓度Hg2+对SOD活性都没有明显差异，仅在72 h时SOD活性在对照组与其他质量浓度处理组之间的差异达到了显著性水平(p<0.05)(见表3)。

表3 Hg2+处理后红裸须摇蚊幼虫的SOD活性

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.4 Hg2+对红裸须摇蚊幼虫体内GST活性的影响

由表4可见：Hg2+胁迫下，不同的处理组红裸须摇蚊幼虫体内GST酶的活性，在暴露24 h，1.6、2.4、3.6、5.4 mg/L各处理组，GST的活性都表现为较高，并且短的暴露时间24 h达到最大值为(0.767±0.082)U/mg。而在高质量浓度(8.1 mg/L)处理组，暴露6 h表现最高，为(0.808±0.060)U/mg。随着作用时间的延长，在24、48、72 h时，GST酶活力逐渐降低，而暴露6 h各处理组酶活性差异显著。同一时间不同质量浓度的Hg2+处理，对GST活性影响的LSD法多重比较检验结果显示，暴露48、72 h的各质量浓度Hg2+对GST活性都没有明显差异(p>0.05)；在6、24 h时，GST活性在对照组与其他质量浓度处理组之间的差异达到了显著性水平(p<0.05)。说明在受到Hg2+胁迫时，不同处理组的红裸须摇蚊幼虫体内GST活性发生明显的剂量-效应关系。

表4 Hg2+处理后红裸须摇蚊幼虫的GST活性

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

3 讨论

关于汞对水生动物的急性毒性研究已有一些报道。在对鱼类和甲壳类动物的研究中，孔祥会等[13]将金鱼幼鱼置于质量浓度为0、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/L的Hg2+溶液中，分别在汞暴露1、7、15 d时取样，测定不同质量浓度Hg2+暴露下SOD、CAT活性及丙二醛(MDA)含量。结果显示，SOD、CAT均表现出在较长的暴露时间及较高质量浓度Hg2+胁迫下的诱导效应，MDA含量也因Hg2+暴露而明显积累。

CAT、POD、SOD、GST等会受到外界刺激的影响，因而对生物机体抗氧化状态的测定、对于理解毒性效应机制及预测生物体内的潜在性损伤是十分重要的[7]。重金属对摇蚊幼虫的抗氧化酶的研究中发现，不同的摇蚊幼虫对污染物的耐受性存在一定的差异，Cd2+对红裸须摇蚊幼虫与其它摇蚊幼虫明显不同，该物种对Cd2+的急性毒性不敏感，表现出非常强的耐受能力[1]。本研究结果显示，CAT和SOD均表现出较长的暴露时间及较高质量浓度Hg2+胁迫下的诱导效应，红裸须摇蚊幼虫为了减弱汞胁迫带来的损害，CAT和SOD均有增加然后减少的抛物线形式的变化。CAT等抗氧化防御系统的一个重要特征，是其活性成分或含量可由于污染物的胁迫而发生改变，从而可间接反映环境中氧化污染的存在，因此可作为环境污染胁迫的指标。本研究发现，红裸须摇蚊幼虫体组织抗氧化防御系统中，主要抗氧化酶CAT和SOD活性对Hg2+具有较高的敏感性，而随着重金属离子暴露质量浓度的升高，其含量和活性均呈现明显的剂量-效应关系，可以作为生物标志物检测水体中Hg2+的早期污染。而且GST活性对Hg2+有诱导效应，具有极高的检测灵敏度，但是，由于检测必须在纯净的溶液中进行，因此作为实际检测物质还具有一定难度[14]。在Hg2+暴露下的红裸须摇蚊幼虫体组织，POD活性表现的规律性不明显，呈相对复杂的变化，因此认为POD不能有效用来检测水体的早期Hg2+污染。Park et al.[15]研究发现，经毒物暴露后，摇蚊幼虫体内GSTs的活性发生了显著的变化。为进一步完善Hg2+对红裸须摇蚊的抗氧化酶系统的研究，如乙酰胆碱酯酶(AChE)、GSTs等酶活性如何，还需要进一步验证。

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