孟 玮，宗治国，史晓宇，张 敬，赵峻峰

(1.河北北方学院附属第一院肿瘤内科，河北 张家口 075000； 2.河北北方学院附属第一院骨外科，河北 张家口 075000)

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，近年来由于人们生活方式转变、环境变化及遗传因素的影响，结肠癌的发病率呈上升趋势[1-2]。研究发现结肠癌的发生发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活密切相关[3-4]。miRNA是一类小分子的非编码RNA，能够结合于靶基因的mRNA 3’UTR区域，参与细胞的增殖、分化与凋亡等[5-6]。miRNA在肿瘤中被分为“原癌miRNA”或者“抑癌miRNA”，进而参与肿瘤的发生发展[3- 4]。miR-126在肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌等多种癌组织中低表达，因此被认为是一种抑癌miRNA，但在结肠癌发生发展过程中的具体机制报道较少[7-8]。同时SOX2是一种高度保守的能够维持胚胎干细胞功能的核转录因子，有研究表明SOX2可能是miR-126的下游靶基因[9-10]，因此本研究将探讨miR-126是否能够通过靶向调控SOX2表达影响结肠癌细胞的增殖与凋亡。

1 材料和方法

1.1 细胞株

结肠癌SW480细胞购于中国科学院细胞库，目录号TCHu172。

1.2 主要试剂与仪器

miR-126 mimics和miR-126 NC均购于上海吉马生物技术有限公司；兔抗人SOX2及GAPDH多克隆抗体均购于美国Abcam公司；胎牛血清，DMEM培养基均购于美国Hyclone公司；BCA蛋白测定试剂盒，MTT均购于南京凯基生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒，LipofectamineTM3000脂质体，一步法miRNA反转录试剂盒均购于大连宝生生物技术有限公司；重组质粒pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt及pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut购于广州锐博生物技术有限公司。

DYCZ-40D型转印电泳仪均购于北京六一仪器厂；Mini-PROTEAN#1658000小型垂直电泳仪，GelDoc 2000凝胶成像系统购于美国伯乐公司；MK3型酶标仪，FACSCanto II型流式细胞仪均购于美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 miRNA的转染

当SW480细胞密度达到50%时候，利用LipofectamineTM3000脂质体将miR-126 mimics和miR-126 NC转染到SW480细胞并于6 h后换液，再继续培养48 h，RT-PCR法检测细胞中miR-126的表达。

1.3.2 RT-PCR法检测细胞中miR-126表达

根据Trizol试剂盒提取细胞中总RNA，并检测总RNA的纯度，接着根据反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，逆转录产物以琼脂糖凝胶电泳。反应体系：Rnase 9.5 μL，模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，UItraSYBR Mixture 12.5 μL。反应程序：预变性：95℃，5 min；变性：95℃，20 s；退火：50℃，30 s；延伸：72℃，30 s。引物序列如下：miR-126:上游引物：5′-GCUCGUACCGUGAGUA AU-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，SOX2:上游引物：5′-GCTACAAGACAACACCCTGAT-3′，下游引物：5′-CAATCTCCTAAGCCACGAG-3′，GAPDH：上游引物 5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游引物：5′-GCTGGTG GTCCAGGGGTCTTACT-3′。

1.3.3 MTT法检测细胞活力

将5×103个SW480细胞接种到96孔板并培养24 h，按“1.3.2”进行转染48 h后，加入20 μL终浓度为5 mg/mL的MTT孵育4 h后，弃去上清液，继续加入150 μL 二甲基亚砜，震荡10 min，在酶标仪570 nm处测吸光值。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况

将8×103个SW480细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.3.2”进行转染48 h后，每组收集1×105/mL个细胞，再加入结合缓冲液吹打混匀后，依次加入5 μL的Annexin V-FITC及PI，继续吹打混匀，并于室温避光孵育10 min，于1 h内在流式细胞仪上进行细胞凋亡分析。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期

将8×103个SW480细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.3.2”进行转染48 h后，每组收集1×105/mL个细胞，加入RNase吹打混匀后于室温下孵育1 h，再加入PI染液于室温下孵育30 min，在流式细胞仪上进行细胞周期分析。

1.3.6 Western blot检测细胞中SOX2表达

将8×103个SW480细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.3.2”转染48 h后，收集细胞并裂解，离心得到上清液就是总蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白煮沸10 min变性后，制作浓缩胶及分离胶，室温水封30 min。30 ng样品上样后进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，PVDF湿法转膜。2%的BSA室温下孵育1 h，一抗溶液(兔SOX2及GAPDH多克隆抗体，稀释度为1∶100)4℃过夜孵育，第2天在室温条件下，于二抗溶液孵育1～2 h，在凝胶成像系统中曝光。

1.3.7 荧光素酶报告基因表达分析

将miR-126 mimics+pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 mimics+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut四组重组载体转染到SW480细胞，采用双荧光素酶系统检测酶活性。计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素梅荧光值/海肾荧光素梅荧光值。

1.4 统计学方法

表1 miR-126 mimics对SW480细胞凋亡及细胞周期的影响Tab.1 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell apoptosis and cell cycle

注：与miR-126 NC比较，**P< 0.01。

Note.Compared with the miR-126 NC,**P< 0.01.

2 结果

2.1 miR-126 mimics转染效果的检测

miR-126 mimics和miR-126 NC转染SW480细胞48 h后，与miR-126 NC组(0.14±0.01)比较，miR-126 mimics组(0.92±0.08)中miR-126表达量显著上调(P< 0.01)。

图1 miR-126 mimics转染效果的检测Fig.1 Transfection effects of miR-126 mimics

2.2 miR-126 mimics对SW480细胞活力的影响

miR-126 mimics和miR-126 NC转染SW480细胞24、48、72 h后，与miR-126 NC组比较，miR-126 mimics组细胞活力逐渐降低(P< 0.01)。

注：与miR-126 NC比较，**P< 0.01。图2 miR-126 mimics对SW480细胞活力的影响Note.Compared with miR-126 NC, **P< 0.01.Fig.2 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell viability

2.3 miR-126 mimics对SW480细胞凋亡及细胞周期的影响

如图3，图4及表1所示，miR-126 mimics和miR-126 NC转染SW480细胞48 h后，与miR-126 NC组比较，miR-126 mimics组细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著提高(P< 0.01)，且细胞周期阻滞于G1期(P< 0.01)。

图3 miR-126 mimics对SW480细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell apoptosis

图4 miR-126 mimics对SW480细胞周期的影响Fig.4 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell cycle

2.4 报告基因分析

将miR-126 mimics+pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 mimics+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut四组重组载体转染到SW480细胞，结果发现miR-126 mimics+pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt组荧光强度最低(P< 0.01)，其它几组荧光强度差异无显著性(P> 0.05)。

注：与miR-126 NC比较，**P< 0.01。图6 miR-126 mimics对SW480细胞中SOX2表达的影响Note.Compared with the miR-126 NC, **P< 0.01.Fig.6 Effect of miR-126 mimics on the expression of SOX2 in SW480 cells

注：与miR-126 NC比较，**P< 0.01。图5 报告基因分析Note.Compared with the miR-126 NC, **P< 0.01.Fig.5 Reporter gene analysis

2.5 miR-126 mimics对SW480细胞中SOX2蛋白及mRNA表达量的影响

如图6所示，miR-126 mimics和miR-126 NC转染SW480细胞48 h后，与miR-126 NC组比较，miR-126 mimics组SOX2蛋白及mRNA表达量显著下调(P< 0.01)。

3 讨论

miRNA是一类高度保守的能够与靶基因3’UTR区域结合的非编码RNA分子，进而负性调控靶基因的转录，参与细胞的增值、分化与凋亡。研究发现miRNA基因组主要位于肿瘤基因的脆性区，因此常作为癌基因或者抑癌基因参与肿瘤的发生发展[3-4]。2003年Michael等[6]学者首次报道了结肠癌中存在差异性表达的miRNA(miR-143及miR-145)，其表达量显著下调，且发现G蛋白γ7和HGK等是其靶基因。后续研究人员通过微阵列芯片分析法及RT-PCR技术不断在肠癌组织中发现异常表达的miRNA[5-6]。至此miRNA作为肠癌的潜在诊断标志物，受到了研究人员的极大关注，并成为近几年的研究热点[5-6]。miR-126是最早在人乳腺癌中被发现的且基因组位于人类染色体9q34.3上的一种抑癌miRNA，在血管丰富的组织中高表达，如肺、心等[7-8]。研究表明 miR-126在多数肿瘤组织中低表达，并与肿瘤的发生发展密切相关[7-8]。如Dfaz等[11]首次发现miR-126在结肠癌中低表达，并与病理分级有关。后续研究者进一步证实了miR-126在结肠癌组织中的低表达，但具体的作用机制尚未明确，因此本研究将对此展开探讨[8, 12]。本研究首先利用脂质体转染miR-126 mimics和miR-126 NC，RT-PCR结果证实转染成功。接着采用MTT及annexin V-FITC/PI流式双染技术检测miR-126 mimics对SW480细胞活力及细胞凋亡的的影响，结果表明miR-126 mimics能显著降低SW480细胞活力，并提高细胞早期凋亡率及晚期凋亡率，此结论与以往观点一致[13]，说明miR-126 mimics能显著的抑制SW480细胞增殖，并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的无限增殖与凋亡受限制源自于细胞周期的不可控制，特别是细胞周期调控点的紊乱，如G1、G2及S期，此细胞周期调控点也是众多抗肿瘤药物的作用靶点[14-15]。因此本研究继续利用流式细胞术检测miR-126 mimics对SW480细胞周期的影响，结果表明miR-126 mimics能使细胞周期阻滞于G1期。从而说明miR-126 mimics能显著的抑制SW480细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

miR-126同众多miRNA一样，基本都是通过靶向调控靶基因转录进而参与细胞的增殖、分化、凋亡及细胞周期等生物学行为。有研究显示SOX2是miR-126的下游靶基因之一[9]，但在结肠癌进展过程中尚未得到验证，因此本研究将探讨miR-126 是否能够靶向调控SOX2的表达。SOX基因家族最早发现于Y染色体缺失的小鼠上，该家族成员广泛分布于鸟类、鱼类、果蝇、哺乳动物中，迄今为止已发现超过30种。SOX-2是SOX基因家族的一员，是与哺乳动物性别决定基因相关的一种核转录因子，对胚胎形成、发育，神经发育，性别决定起着重要作用，特别对于维持胚胎干细胞的全能性起着关键性作用。近些年来研究也发现SOX2对肿瘤的发生发展过程起着重要作用，在结肠癌、肺癌、肝癌中高表达[10]。本研究首先探讨miR-126 mimics对SW480细胞中SOX2表达的影响，western blot及RT-PCR结果显示miR-126 mimics组SOX-2蛋白及mRNA表达量均较miR-126 NC组显著下调，说明miR-126 mimics能够负性调控SOX2表达。接着荧光素酶报告基因表达也证实了miR-126 mimics能靶向结合于SOX2的3’UTR区域，进一步说明miR-126 mimics 在SW480细胞中对SOX-2的负性调控，继而发挥其对SW480细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。

综上所述，miR-126 mimics能显著降低SW480细胞活力，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1期，是通过负性调控SOX2表达实现的。

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