邝少松，杨 林，严家荣，谭巧燕，代路路，唐小江

(广东省医学实验动物中心，广东 佛山 528248)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种慢性、多系统受累的自身免疫性疾病[1]，其发病机制复杂，突出表现为多种自身抗体并通过免疫复合物等途径诱导的炎症免疫反应，而炎症通路的激活、炎症细胞(特别是巨噬细胞和T细胞)的浸润及炎症因子的表达发挥着重要作用[2-4]。研究表明，白细胞介素(interleukin, IL)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 等细胞因子参与SLE的发病过程，尤其以T、B淋巴细胞免疫紊乱、产生大量的自身抗体为特征[5]。T淋巴细胞是高度异质性的群体，根据发育的过程中出现的分化抗原的不同，可分为CD4+T和CD8+T细胞，研究发现T细胞的功能主要是通过其分泌的细胞因子介导的。MRL/lpr小鼠作为一种研究狼疮发病的代表性动物模型，在16周龄自发产生与人类疾病类似的狼疮症状[6]。本研究选取了4种细胞因子(IL-2、IL- 4、IL-17、TNF-α)和T淋巴细胞的主要表面标志CD4和CD8进行检测，目的在于对不同月龄的MRL/lpr小鼠和野生型小鼠进行一系列免疫机制基础数据比较，为日后的广大相关领域的科研工作者提供基础数据及参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

B6.MRL-FaslprNJU小鼠，C57小鼠，SPF级雌性。3月龄体重15～18 g、4月龄体重18～22 g、5月龄体重22～25 g、6月龄体重25～28 g雌性B6.MRL-FaslprNJU小鼠各10只，3月龄15～18 g野生型雌性C57小鼠10只，共50只。购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤) 2013-0002]。所有实验在广东省医学实验动物中心完成[SYXK(粤) 2013-0002]，经广东省医学实验动物中心伦理委员会审查，福利伦理审查证号B201404-06。

1.2 主要试剂与仪器

小鼠抗双链ds-DNA抗体(IgG)、白介素IL-2、白介素IL- 4、白介素IL-17、 肿瘤坏死因子TNF-α ELISA试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司； Anti-CD3、Anti-CD4抗体购自Abcam公司；全波长酶标仪，型号Multiskan Go，美国Thermo Fisher公司；流式细胞仪，型号BD Accuri C6 美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 解剖取材

小鼠称体重后，采用异氟烷吸入麻醉后摘眼球采集血液，离心，取血清置于-20℃保存；采集血液后断颈处死，常规消毒动物腹部皮肤，无菌打开腹腔，取心、肝、脾、肺、肾称重，计算脏器系数；钝性去除被膜取脾，脾组织分成两份置于-20℃保存备用。

1.3.2 指标检测

ELISA检测血清中小鼠抗双链ds-DNA抗体，按照试剂盒说明书进行操作；取脾组织用ELISA检测免疫因子白介素IL-2、IL4、IL17、肿瘤坏死因子TNF-α，按照试剂盒说明书进行操作；运用流式细胞仪检测脾淋巴细胞CD3含量及CD4/CD8细胞比率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同月龄MRL/lpr小鼠及正常C57BL/6小鼠脏器系数比较

与3月龄C57小鼠相比，3～6月龄MRL小鼠心脏系数、肝脏系数、肺脏系数、双肾系数差异无显著性(P> 0.05)，3～6月龄MRL小鼠脾脏系数均显著升高(P< 0.05)(见表1)。

注：与3月龄C57小鼠比较，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.Compared with the 3-month old C57 mice，*P< 0.05；**P< 0.01．

表2 MRL/lpr小鼠与C57小鼠抗ds-DNA抗体水平的变化Tab.2 Changes of anti ds-DNA antibody levels in the MRL/lpr mice and C57 mice

注：与3月龄C57小鼠比较，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.Compared with the 3-month old C57 mice,*P< 0.05；**P< 0.01．

2.2 不同月龄MRL/lpr小鼠及正常C57BL/6小鼠抗ds-DNA抗体比较

与3月龄C57小鼠相比，3～6月龄MRL/lpr小鼠血清ds-DNA抗体浓度均显著升高(P< 0.05)，但MRL/lpr小鼠不同月龄间ds-DNA抗体浓度之间无明显趋势(见表2)。

2.3 免疫因子白介素IL-2, IL- 4、IL17、肿瘤坏死因子TNF-α检测

与3月龄C57小鼠相比，3～6月龄MRL/lpr小鼠白介素IL-2浓度、肿瘤坏死因子TNF-α均显著升高(P< 0.05)，MRL/lpr小鼠不同月龄间白介素IL-2、TNF-α浓度无明显趋势；与3月龄C57小鼠相比，3～6月龄MRL/lpr小鼠白介素IL- 4、IL-17浓度差异无显著性(P> 0.05)；MRL/lpr小鼠随着月龄增大，白介素IL-17浓度显著升高(P< 0.05)(见图1 A～D)。

2.4 脾淋巴细胞CD3、CD4/CD8检测

与3月龄C57小鼠相比， 6月龄MRL/lpr小鼠脾淋巴细胞CD3浓度显著降低(P< 0.01)，MRL/lpr小鼠随月龄增大CD3含量和D4/CD8比率有下降趋势，但差异无显著性。(见表3)

注：(A)IL-2浓度；(B)IL- 4浓度；(C)IL-17浓度；(D)TNF-α浓度。与C57BL/6小鼠比较，*P< 0.05；与3月龄MRL/lpr小鼠比较，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01。图1 不同月龄MRL/lpr和C57BL/6小鼠血液炎症细胞因子浓度Note.(A) Concentration of IL-2. (B) Concentration of IL- 4. (C) Concentration of IL-17. (D) Concentration of TNF-α. Compared with the C57BL/6 mice, *P< 0.05. Compared with the 3-month MRL/lpr mice, ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01.Fig.1 Blood concentration of inflammatory cytokines in the MRL/lpr mice and C57BL/6 mice at different ages

组别GroupsCD3(%)D4/CD8C57-3月龄3-montholdC57mice34.99±5.371.50±0.42MRL/lpr-3月龄3-montholdMRL/lprmice30.77±13.151.53±1.13MRL/lpr-4月龄4-montholdMRL/lprmice29.96±6.531.27±0.28MRL/lpr-5月龄5-montholdMRL/lprmice24.93±6.511.45±0.13MRL/lpr-6月龄6-montholdMRL/lprmice23.10±2.85**1.18±0.12

注：与3月龄C57小鼠比较，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.Compared with the 3-month old C57 mice，*P< 0.05；**P< 0.01．

3 讨论

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多系统、多器官受累的全身性自身免疫病，T细胞异常可能是SLE发病的重要机制之一。SLE患者T细胞异常主要表现为辅助性T细胞(Th)活性增高，抑制性T细胞(Ts)活性下降。Th细胞按照功能可分为Th1、Th2和Th17细胞。在活动性红斑狼疮中，Th细胞分泌的细胞因子表达异常。Thl细胞因子水平反映的是细胞免疫功能水平，Th2细胞因子水平反映体液免疫功能，Th17细胞以分泌细胞因子IL-17为特征，Thl，Th2与Th17细胞之间的相互调节，令机体的免疫应答处于一种精细而复杂平衡的状态，细胞因子内部平衡的改变导致机体免疫的紊乱，进而诱导SLE疾病的发生和发展。IL-17能促进炎性反应以及加强机体的免疫防御功能[7]。IL-2促进B细胞分化增殖，启动免疫球蛋白J链的翻译合成，增强抗体的分泌，使B细胞分化成为能够产生免疫球蛋白的活化细胞。TNF-α主要由单核巨噬细胞分泌，最主要的功能是参与机体的防御反应，是重要的促炎症因子和免疫调节因子，它通过抑制T细胞信号传导、促进B细胞和树突状细胞的生长以及诱导凋亡分子的产生等，参与自身免疫性疾病的发病机制[8]。本研究显示3～6月龄MRL/lpr小鼠血清IL-2和TNF-α的水平比正常小鼠显著升高；IL- 4、IL-17的水平与正常小鼠相比差异不显著。IL-2和TNF-α同属Th1型细胞因子，IL- 4、IL-17分别属于Th2、Th17型细胞因子，由此我们推测在3～6月龄MRL/lpr小鼠狼疮样病变发展过程中，Th1型细胞因子占优势，细胞因子网络的失衡，导致了机体免疫紊乱。因此，IL-2和TNF-α在MRL/lpr小鼠模型SLE疾病的发生和发展的过程中起到了关键的作用。

CD3可表达于所有成熟T细胞表面，它是由五条肽链组成的复合分子，与其抗原受体(TCR)由非共价连接的方式形成完整的TCR/CD3复合体，共同参与对抗原刺激的免疫应答，而T细胞亚群中的CD4+细胞与CD8+细胞的相互制约及平衡对机体免疫应答具有重要的调节作用[9]。本研究显示，6月龄MRL/lpr小鼠脾淋巴细胞CD3浓度显著降低，D4/CD8比率下降，表明SLE存在T淋巴细胞失衡，T细胞功能紊乱现象。

抗ds-DNA抗体是一种能与天然的脱氧核糖核酸(DNA)结合的成分，它与细胞核的反应位点在于DNA(外围区)脱氧核糖磷酸框架上。抗ds-DNA抗体对SLE的诊断高度特异，是红斑狼疮的诊断标准之一，它能促进抗原抗体复合物形成，激活补体，加剧了炎症的发生，造成组织损伤[10]。本研究显示3月龄MRL/lpr小鼠血清中的抗ds-DNA抗体浓度是正常的C57小鼠的1.7倍以上，MRL/lpr小鼠抗ds-DNA抗体的阳性率高达90%以上，表明MRL/lpr小鼠3月龄开始已出现SLE的特征，而且呈现出高水平的抗ds-DNA抗体。综上，MRL/lpr小鼠是目前最常用的自发性系统性红斑狼疮动物模型之一，研究初步表明MRL/lpr小鼠在3月龄已开始出现T淋巴细胞失衡，免疫损伤的表现，在SLE发病发展过程中，Th1型淋巴细胞因子可能SLE免疫抑制的关键因素之一。

参考文献：

[1] 王晶晶，严尚学，张小丹，等. TACI融合蛋白对MRL/lpr小鼠免疫功能的作用及其部分机制 [J]. 安徽医科大学学报，2011, 46(9): 865-870.

[2] Nowling TK, Gilkeson GS. Mechanisms of tissue injury in lupus nephritis [J]. Arthritis Res Ther, 2011, 13(6): 250.

[3] Gigante A, Gasperini ML, Afeltra A, et al. Cytokines expression in SLE nephritis [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2011, 15(1): 15-24.

[4] 梁柳琴, 许韩师, 叶玉津, 等. 白细胞介素-15在狼疮性肾炎活动病变中的临床意义 [J]. 中国病理生理杂志, 2008, 24(8): 1581-1584.

[5] 袁敏, 慕思娟, 崔慧娟, 等. DNA甲基化转移酶在MRL/lpr狼疮鼠CD4+T淋巴细胞中的表达水平研究及功能分析 [J]. 中华风湿病学杂志, 2009, 13(8): 521-524.

[6] Liu J, Karypis G, Hippen KL, et al. Genomic view of systemic autoimmunity in MRL/lpr mice [J]. Genes Immun, 2006, 7(2): 156-168.

[7] 秦卫松, 刘志红. Th17细胞与自身免疫性疾病 [J]. 肾脏病与透析肾移植杂志，2008, 17(5): 453-456.

[8] 叶倩舲, 翟志敏, 王会平, 等. 多发性骨髓瘤与系统性红斑狼疮患者血浆IL-2、TNF-α检测 [J]. 安徽医科大学学报, 2016, 51 (2): 255-258.

[9] 钱齐宏, 张学光, 於葛华, 等. T细胞亚群及共刺激分子表达与系统性红斑狼疮免疫病理的关系 [J]. 苏州大学学报(医学版), 2002, 22(1): 8-12

[10] 吴希国，刘秀珍，马越. 173例系统性红斑狠疮患者ANA，ENA和ds-DNA抗体的联合检测分析 [J]. 中国卫生检验杂志, 2012, 22 (4): 781-782.