孙建莉，陈勇华，林赛争，刘晓，洪琼怿，李文丽，曹群奋

胃癌的发生与幽门螺旋杆菌（Hp）感染关系密切，Hp正常条件下呈螺旋形，但在对其生长不利的环境中Hp易发生细胞壁缺失而形成球形幽门螺杆菌（Hp-L型）。越来越多的实验研究表明胃癌组织中Hp主要以L型存在，Hp-L型感染后导致胃黏膜氧自由基和细胞因子等的释放，进而引起细胞DNA损伤及影响癌基因和抑癌基因表达的失调，导致胃上皮细胞增殖与凋亡失衡。Hp-L型感染与胃癌发生发展关系的研究成为近年来国内学者探究的热点。

肿瘤易感基因101（TSG101）及人类Runt相关转录因子（RUNX3）分别为肿瘤易感基因及抑癌基因，二者是胃癌发生发展中重要的调控基因，其可通过多种途径调控细胞的信号转导及其他生物学效应，进而影响细胞的生长发育与凋亡。本文旨在研究Hp-L型感染是否可通过调节TSG101及RUNX3的表达来参与胃癌的发生发展，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验样本 收集杭州市迪安诊断中心2015年1月至2016年12月存档的石蜡包埋胃癌组织89份（来自89例患者）为实验组，随机抽取35份对应癌旁组织为对照组。所有组织切片均经两名专业病理医师确认，所有患者的临床资料完整。所有患者术前未行根除Hp、放化疗及其他治疗史。其中男58例，女31例；年龄41～81岁，平均年龄61岁；高、中分化38例，低分化51例；胃癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期60例。

1.2 实验试剂 鼠抗人RUNX3单克隆抗体、兔抗人TSG101抗体购自Abcam公司；兔抗人Hp-L型抗体、二抗、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木素：Sigma公司。

1.3 实验方法 所有组织切片予烤片后采用SP法进行免疫组化染色。二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，阻断、灭活内源性过氧化物酶，抗原修复、滴加一抗及二抗（各一抗稀释浓度为均为1∶100，PBS代替一抗作为阴性对照），DAB反应染色，苏木素复染，干燥，封片，拍照。

1.4 判断标准 RUNX3的阳性部位在细胞质或细胞核中（封二彩图7），TSG101阳性部位在细胞质内，以出现着色清晰的棕黄色颗粒为阳性标准（封二彩图8）。RUNX3及TSG101的评分标准：显微镜下观察，每张免疫组化切片随机选择 5个不同的视野（×200）观察，并判读阳性表达强度和阳性率。染色结果采用半定量分析方法：以染色强度结合阳性细胞数百分比进行评分。染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0分，轻微为1分，中度为2分，重度为3分。阳性细胞百分比即每张免疫组化切片选择 3个不同的视野（×200）进行观察：0～5%评为0分，6%～25%评1分，26%～50%评2分，51%～75%评3分，＞75%均评为4分。对每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比评分，最终评分为阳性细胞百分比与染色强度之和，其中≥4分评为阳性，＜4分评阴性。

Hp-L阳性标准为细胞膜或胞质内着棕色细颗粒（（封二彩图9）。指标以阳性视野的数目判读阳性强度，无阳性视野记为阴性（－），1个或2个阳性视野记为弱阳性（+），3个或4个阳性视野记为中度阳性（2+），5个阳性视野记为强阳性（3+）。

1.5 统计方法采用SPSS22.0统计软件进行数据处理，计数资料比较采用检验。＜0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 TSG101在胃癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系 胃癌组中TSG101蛋白表达阳性率为62.9%（56/89），对照组中阳性表达率为 37.1%（13/35），胃癌组织中TSG101蛋白表达显著高于癌旁组织（2=6.764，P ＜ 0.05）。在胃癌组中，TSG101蛋白的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移均有关（均P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期均无关（均P＞0.05）。见表1。

2.2 RUNX3在胃癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系 胃癌组中RUNX3蛋白表达阳性率为30.3%（27/89），对照组中阳性表达率为 82.9%（29/35），胃癌组织中RUNX3蛋白表达显著低于癌旁组织（2=27.980，P ＜ 0.05）。RUNX3蛋白在胃癌组织中的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均有关（均P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度均无关（均P＞0.05）。见表1。

2.3 Hp-L型在胃癌组织及癌旁组织中的感染情况Hp-L型在胃癌组中的阳性率为71.9%（64/89），对照组中的阳性率则为28.6%（10/35）。胃癌组织中Hp-L型感染率显著高于癌旁组织（2=19.608，P ＜0.05）。

2.4 胃癌组织中Hp-L型感染与TSG101、RUNX3蛋白表达的关系 Hp-L型阳性及阴性的胃癌组织中，TSG101蛋白表达阳性率分别为70.3%（45/64）、44.0%（11/25），两者差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。RUNX3蛋白表达阳性率则分别为18.8%（12/64）和60.0%（15/25），两组差异有统计学意义（2=14.475，P＜0.05）。见表2。

3 讨论

Hp作为胃癌的独立危险因素已被全球公认，根除Hp可有效降低胃癌的发生率。但在根除Hp治疗的过程中，不规范使用抗生素等易致Hp出现L型变异[1]，一定条件下Hp-L型还可回复成原菌形态，使病变进展或复发，不断造成胃组织损伤，引起持续的炎症，增加癌变机会，故L型与原菌相比具有更大的黏附性、侵袭性和危险性。本文证实胃癌组织中Hp-L型感染率显著高于癌旁组织。研究发现Hp-L可与巨噬细胞移动抑制因子（MIF）共同促进血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）的表达，从而促进胃癌的浸润和转移DNA修复基因着色性干皮病基因F（XPF）在核苷酸切除修复途径中发挥着至关重要的作用，XPF的高表达提示肿瘤预后不良；而Hp-L可上调胃癌中XPF的表达[2-3]。

表1 胃癌组织中TSG101及RUNX3蛋白的表达与胃癌临床病理因素的关系 例

TSG101在多数恶性肿瘤组织或细胞系中呈现高表达。本实验发现与癌旁正常组织相比，胃癌组织中TSG101蛋白表达显著上调，且其表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关，该结果与文献[4-5]的实验结论一致，这说明TSG101在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要作用，该过程可能是TSG101通过下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)介导的，E-cadherin是一种重要的介导细胞互相黏附的跨膜糖蛋白分子。张敏等[6]研究证实高表达TSG101的SGC-7901胃癌细胞侵袭和转移能力较未转染组明显增强。此外TSG101可通过上调VEGF的表达促进胃癌血管形成[7]，而血管的大量形成则可促进胃癌的浸润和转移。本研究还发现胃癌组织Hp-L阳性组较其阴性组TSG101蛋白表达显著增加，提示Hp-L还可通过上调胃癌组织中TSG101的表达来影响胃癌的发生发展，具体机制尚不明确，需待进一步研究。

RUNX3可调节多个基因的表达来参与细胞的生长、发育、凋亡、信号转导及生物学效应，从而在肿瘤的发生发展中扮演了很重要的角色。一项最新的Meta分析显示RUNX3基因启动子区DNA的甲基化正是该基因低表达或缺失的主要原因，甲基化修饰作用主要发生在DNA的CpG岛[8]。此外RUNX3也可通过杂合性缺失而失活，进而促进肿瘤的发生发展[9]。本实验证实 RUNX3的下调或缺失在胃癌的发生与进展中发挥了重要的作用，RUNX3在胃癌中的低表达或缺失与Hp-L型感染有一定关系，其机理可能与细胞毒素相关基因蛋白（CagA）促使RUNX3启动子区DNA的甲基化有关[10]。

表2 Hp-L型阳性及阴性的胃癌组织中TSG101及RUNX3的表达 例

参考文献：

[1] 吴晓娟,陈峥宏,王菲,等.阿莫西林诱导L型形成对幽门螺杆菌感染治疗效果的影响[J].中国抗生素杂志,2013,38(9)：720,S1-S3.

[2] 欧玉荣,康敏,周蕾,等.胃癌中幽门螺杆菌L型感染与MIF、MMP9、VEGF表达的关系[J].南方医科大学学报,2014,34(2)：180-187.

[3] 王名法,刘友斌.XPF、P53蛋白在胃癌组织中的表达及与幽门螺杆菌L型感染的关系[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(10)：1089-1094.

[4] 靳雁.TSG101在胃癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学,2009,17(9)：1725-1726.

[5] 艾小顺,刘友富,董伟,等.TSG101与Ecadherin在胃癌组织表达的相关性及预研究[J].现代肿瘤医学,2012,20(12)：2591-2594.

[6] 张敏,王琦,任晓静,等.肿瘤易感基因101表达对胃癌细胞侵袭和转移的影响[J].中华医学杂志,2013,93(16)：1219-1223.

[7] 杨扬,张敏,任晓静,等.肿瘤易感基因101对胃癌细胞血管形成的影响[J].中华实验外科杂志,2014,31(11)：2420-2422.

[8] Liu X,Wang L,Guo Y,The association be tween runt-related transcription factor 3 gene promoter methylation and gastric cancer：A meta-analysis[J].JCancer Res Ther,2016,12(Supplement)：50-53.

[9]Mori T,Nomoto S,Koshikawa K,et al.Decreased ex-pression and frequent allelic inactivation of the RUNX3 geneat 1p36 in human hepatocellular carcinoma[J].Liver Int,2005,25(2)：380-388.

[10]Choi J,Kim SG,Kim BG,et al.Helicobacter pylori eradication modulatesaberrant CpGisland hypermethylation in gastric carcinogenesis[J].Korean JGastroenterol,2016,68(5)：253-259.