牡丹花瓣高效液相色谱指纹图谱研究*

2018-04-25华梅原晓龙王毅杨卫陈剑马惠芬呼延丽杨宇明王娟

西部林业科学 2018年1期

华梅,原晓龙,王毅,杨卫,陈剑,马惠芬,呼延丽,杨宇明,王娟

(1.云南省林业科学院,云南昆明650201;2.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室,云南昆明650201)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)为毛茛科(Ranunculaceae)芍药属(Paeonia)多年生落叶小灌木。花色泽艳丽,素有“花中之王”的美誉。牡丹品种繁多，色泽亦多，以黄、绿、肉红、深红、银红为上品，尤其黄、绿为贵。牡丹花大而香，故又有“国色天香”之称[1-2]。牡丹不仅有观赏价值，而且还具有很高的药用价值[3-4]。将牡丹的根茎加工制成“丹皮”，是名贵的中草药。

牡丹除了观赏、药用外，其种子可榨油。油用牡丹是一种新兴的木本油料作物，具备高产出、高含油率(籽含油率22%)、高品质(不饱和脂肪酸含量92%)和低成本(油用牡丹耐旱耐贫瘠，适合荒山绿化造林、林下种植；一年种百年收，成本低)的特点[5-6]。经国际权威检测机构PONY检测和国家粮油中心检测分析：牡丹籽油不饱和脂肪酸含量92%，其中α-亚麻酸的含量超过40%。因含有较高比例的亚麻酸，牡丹油一度被称为“液体黄金”[7-8]。从2011年3月始，牡丹籽油已被国家卫生部监督局列为新资源食品，牡丹籽正式成为我国木本油料研究中的新型油料[9]。目前用于商业生产中的油用牡丹仅有凤丹(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang)和紫斑(Paeoniarockii)2个品种。因此在各地大力推广油用牡丹的同时，具有观赏、药用和油用价值的牡丹也在各地大规模的引种种植。在引种种植牡丹获得观赏、药用和油用价值的同时，也获得大量的附加产品，如牡丹花瓣产品及从牡丹花瓣中提取类黄酮及花青素。

已有文献报道，牡丹花瓣中主要的类黄酮有异杞柳苷、山奈酚、槲皮素和异鼠李素等[10]，主要的花青素为矢车菊素、芍药素和天竺葵素[11]。类黄酮和花青素都具有非常高的药用价值[12-13]，常用的检测方法有紫外可见分光光度法(UV-VIS)和高效液相色谱法(HPLC)[14]，HPLC法在定性分析及含量测定方面具有广泛的应用[15-16]。采用现代光谱(中红外光谱MIR[17]、紫外光谱UV[18])、色谱技术〔高效液相色谱(HPLC[19])、气相色谱(GC[20])、高效薄层色谱(HPTLC[21])〕构建特征图谱的指纹图谱技术，为质量评价提供了技术支撑[22]。郭鑫等采用指纹图谱技术对8个不同产地秦艽(Gentianamacrophylla)主要药性化学物质进行了分析，结果表明8个不同产地秦艽指纹图谱共有6个主要共有峰，可作为鉴别和控制秦艽药材质量的主要依据[23]。朱玲英等研究建立凤仙透骨草(Impatiensbalsamina)HPLC指纹图谱分析方法,为其质量控制和药材鉴别提供依据，该方法准确、简单、稳定,可用于凤仙透骨草的鉴别和质量控制[24]。

为了解在引种种植过程中牡丹花瓣活性成分的变化，达到控制牡丹花瓣样品质量的要求，本研究首次采用高效液相(HPLC)指纹图谱法，对不同引种种植地不同品种牡丹花瓣样品中化学成分进行分析，以期建立不同引种地不同品种牡丹花瓣样品指纹图谱的分析方法，并评价各引种牡丹花瓣样品的相似度，最终达到控制其质量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料 9批牡丹花瓣样品均为引种，分别采自曲靖马龙牡丹种植基地和云南省林业科学院树木园牡丹种植基地，品种有鲁粉、白雪塔、雪里紫玉、赵粉、芳纪、凤丹(白色花和粉色花)，详细见表1。

表1 不同批次牡丹花瓣样品

注：云南省林业科学院树木园牡丹种植基地的牡丹采集时间为2016年3月28日；曲靖马龙牡丹种植基地采集时间为2016年3月30日。

试剂乙腈、甲醇为色谱纯；水为蒸馏水。槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器设备

安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),Agilent Eclipse plus C18色谱柱(4.6×150mm,5μm)，ChemStation色谱工作站，具塞试管(20mL)。

1.3 实验方法

(1) 对照品溶液的配制精密称取对照品槲皮素、异鼠李素、山奈酚各23.6mg,用10mL甲醇分别配制成2.36mg/mL的对照品溶液。

(2)供试品溶液的配制精密称取牡丹花瓣鲜花(实际称量重量如表1所示),于液氮中研碎后放入具塞试管中，分别加入10mL 70%甲醇溶液(白色花)或1%浓盐酸的甲醇(粉色花)，置于冰箱中4℃过夜提取。提取液用0.45μm 针头过滤器过滤后于4℃冰箱保存，用于HPLC分析。

(3) HPLC色谱条件采用Eclipse plus C18色谱柱(4.6×150mm,5μm)，以1%乙酸(A)-乙腈(B)作为流动相梯度进行洗脱，洗脱时间为0-10min，0%-20%B；10-40min，20%-60%B；40-50min，60%-20%B；50-60min，20%-60%B，流速0.8mL/min，检测波长360nm，柱温35℃，进样量10μL。

(4) 指纹图谱评价方法采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)生成对照指纹图谱，作为指纹图谱相似度评价的基础图谱。

(5) 聚类分析方法采用SPSS 统计分析软件，以6个共有峰的峰面积为变量对结果进行聚类分析(Euclidean 和ward法)。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱的建立与分析

2.1.1 共有峰的色谱图及样品特征图谱

图1为S1样品的HPLC图，图中标示出1-6号峰，各峰都实现了基线分离。将9个不同引种地不同品种牡丹花瓣样品的HPLC图谱导入相似度评价系统软件进行指纹图谱分析。经分析，9个样品共标定了6个共有峰，结果如图2所示。从下往上色谱峰图相对应的样品为S1-S9，最上边的R为中药指纹图谱相似度评价系统生成的对照光谱图。每个样品共有峰总面积比例均>95%，符合指纹图谱研究的要求。6个共有峰中，第5号峰分离度好，峰面积最大，以每个样品的第5号峰为参照峰(S)，分别计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，结果见表2。

图1 S1样品HPLC色谱图

图2 9个牡丹花瓣样品HPLC特征图谱重叠图

编号12345(S)6S1069107080916097710001029S2069107110916097710001030S3069107090916097710001029S4069207090916097710001029S5069107090916097710001029S6069207090917097710001029S7069207130917097710001029S8069207130916097710001029S9069207120917097810001029平均值069207100916097710001029RSD/%009602660073003410000047

表3 9个牡丹花瓣样品指纹图谱共有峰相对峰面积

从样品共有峰的相对保留时间(表2)可以看出，各样品共有峰的相对保留时间非常接近，RSD在0.034 1%-0.265 6%，表明共有峰选择的准确性。从表3样品共有峰的相对峰面积结果可以看出，不同样品各共有峰的峰面积相差比较大，表明不同引种地不同品种间相同的成分含量差异显著。

2.1.2 样品相似度结果

在中药指纹图谱相似度评价系统中采用夹角余弦法，以S1号样品的谱图峰为对照峰，对各样品进行整体相似度评价。将9个样品谱图导入相似度系统，软件自动生成各样品的相似度结果，结果见表4。

表4 9种不同引种牡丹花瓣样品相似度

从表4可以看出，9个样品相似度最高为0.999,最小为0.862，平均相似度为0.984，表明9个样品整体差异不大。

2.2 含量差异分析

通过对槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品的比较，确定了2号峰、4号峰及6号峰分别为槲皮素、山奈酚和异鼠李素。根据不同样品中槲皮素、异鼠李素、山奈酚的峰面积结果可以看出，牡丹花瓣样品相同成分的含量差异性很大,异鼠李素含量最高的样品为S9，山奈酚含量最高的样品为S9，槲皮素含量最高的样品为S6(表5)。

2.3 不同产地牡丹花瓣样品聚类分析

以不同引种地牡丹花瓣共有峰面积为变量,对9个不同引种地的牡丹花瓣样品数据进行系统聚类分析。结果(图3)可知,S4、S7与S3样品最先聚为一类,S2、S5样品和S8样品聚为一类，S1样品和S6样品聚为一类，说明各引种地及不同品种间相同成分的含量差异较大。

2.4 方法学考察

精密度试验取S1号样品，连续进样 5 次，记录图谱，考察各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD。结果(表6)表明，各色谱峰的相对保留时间基本一致，共有峰1峰面积的RSD为1.8%( RSD值<5%)。

图3 9个牡丹花瓣样品的聚类分析树状图

S1共有峰1峰面积/mAU峰面积平均值/mAURSD/%12423922391232476624538218424931524843

表7 重现性试验

重现性试验取S4号样品5份，按供试品溶液制备方法操作，记录图谱，考察各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD。结果(表7)表明，各色谱峰的相对保留时间基本一致，共有峰1峰面积的RSD为2.1%(RSD值<5%)。

表8 稳定性试验

稳定性试验取S6号样品，分别在0、5h、9h、12h、15h、18h测定,记录图谱，考察各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD。结果(表8)表明，各色谱峰的相对保留时间基本一致，共有峰1峰面积的RSD为3.6%(RSD值<5%)。

通过方法学考察，以样品的峰面积为标准的仪器的精密度，样品的重现性及稳定性均符合指纹图谱研究的技术要求。

3 结论与讨论

指纹图采用一定的分析手段(MIR、UV、HPLC、GC、HPTLC)[17-21]，得到能够标示其特征性共有峰的图谱，强调了同一药材群体的相似性，即物种群体内的唯一性。通过指纹图谱的特征性可以有效鉴别样品真伪与产地，通过对其主要特征峰面积或比例的限定，可有效控制样品的质量[22]。牡丹花瓣，作为牡丹产业发展的副产品之一，对其中化学成分的分析极为重要。尤其是不同产地不同品种牡丹花瓣主要成分的分析及组成差异分析，对牡丹花瓣产品质量评价和开发奠定基础。指纹图谱能实现不同产地不同品种牡丹花瓣间化学成分差异的分析，高效液相色谱能对牡丹花瓣样品的成分进行快速、高效的分析。高效液相色谱与指纹技术的联合，能为牡丹花瓣的质量控制提供技术支撑。

本研究采用高效液相色谱进行分析,比较研究了不同引种地不同品种牡丹花瓣主要成分差异，采用指纹图谱相似度评价软件首次建立了引种牡丹花瓣HPLC指纹图谱。图谱显示了不同引种地不同品种牡丹花瓣有效成分差异以及主要成分分布情况，分离标定出6个共有峰。共有峰峰形良好，分离度高，可作为牡丹花瓣的特征指纹。以峰面积的变化情况考察了仪器的精密度，同时考察了样品在制备及放置过程中的重现性及稳定性，结果均符合指纹图谱研究的技术要求。

通过对槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品色谱图的比较，确定了2号峰、4号峰及6号峰分别为槲皮素、山奈酚和异鼠李素。分析不同样品槲皮素、异鼠李素、山奈酚的峰面积结果，表明不同引种地不同品种牡丹花瓣样品相同成分的含量差异性很大。在相似度评价系统中以S1号样品的谱图峰为对照峰，对各样品进行整体相似度评价，结果表明9个样品整体差异不大。以不同引种地牡丹花瓣共有峰面积为变量，对9个不同引种地的牡丹花瓣样品数据进行系统聚类分析，结果可知，各引种地不同品种间相同成分的含量差异较大。本研究建立的牡丹花瓣指纹图谱技术，可为评价各引种地牡丹花瓣样品的相似度和最终控制其产品质量提供方法支撑。

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