戴杰雨，姜永华，张玉洁，王豪杰，刘潇然，刘翠华，任小林*

HD-Zip家族是植物特有的一类转录因子，因其含有同源异型盒（homeobox domain，HD）与亮氨酸拉链结构（leucine zipper，Zip）而得名。其结构与动物中的HDZip蛋白有所不同，表明很可能在高等植物的生长发育过程中具有不同寻常的意义[1]。HD-ZipI亚家族的成员可能是整个家族中被研究最多的，从植物种子的发育[2]、花的开放与衰老[3-4]到果实的发育至衰老[3,5]等一系列生长发育事件都有研究报道[6-7]。众多研究表明，HD-ZipI通过植物激素的信号转导，参与植物逆境胁迫的响应；并且被发现既有正调控也有负调控，是植物蛋白高级结构的一部分[7-9]。因此，HD-ZipI亚家族在植物的生命周期中发挥着重要的调控作用。

模式植物番茄中，LeHB-1作为LeACO1的转录因子，通过与其互作调控乙烯的合成，进而影响番茄果实成熟衰老的进程[3]。于巧平等[10]通过BLAST苹果EST库获得了目标EST序列，从澳洲青萍花器总cDNA中克隆到了MdHB1全长序列；苹果MdHB1属于HD-ZipI亚家族，被认为是MdACO1的转录因子。李兴亮[11]发现，MdHB1与MdSnRK2.4功能域STKC（Ser/Thr protein kinasec）发生物理互作，使自身功能域HD被蛋白磷酸化修饰，引起MdACO1启动子活性的改变而影响乙烯的合成；这与以前的研究者推测其参与苹果果实的成熟与衰老进程相吻合，病毒诱导沉默实验结果也支持这一结论[12]。本实验室前期探索了该基因在苹果的不同器官、不同发育时期的表达模式，结果表明在嘎啦的花瓣和花后40 d表达水平较高[13]；通过构建酵母双杂交cDNA文库，筛选了与MdHB1互作的多个蛋白，涉及植物的胁迫响应、能量代谢、光合作用等，表明MdHB1在苹果生长发育过程中功能广泛[14]；通过β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因瞬时表达实验等分析了MdHB1基因启动子中乙烯响应元件，表明乙烯可以诱导MdHB1的表达[15]。综上，MdHB1很可能与其他家族成员类似，广泛参与苹果生长发育的调控与环境胁迫的响应。目前关于功能的研究主要是通过转录水平的变化来揭示，而转录因子最终是以蛋白的形式执行功能的，因此蛋白方面的研究对于揭示MdHB1的功能十分必要。本研究利用大肠杆菌得到原核表达的MdHB1融合蛋白，Ni-NTA亲和柱纯化后作为抗原制备多克隆抗体；通过Western Blot实验和间接酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）实验，结果表明所得多克隆抗体效价较高，特异性良好，不仅能从菌体总蛋白中特异性识别MdHB1，也能从苹果幼叶总蛋白中成功检测MdHB1蛋白，为进一步研究MdHB1提供了有力工具。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果叶片采集于西北农林科技大学园艺场，品种为“澳洲青萍”。选取幼嫩新生叶，采集后随即带回实验室，液氮速冻，－80 ℃保存备用。

蛋白原核表达载体pGEX-6p-1和pET-28a（＋）本实验室保存；表达菌株BL2（DE3） 北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶（BamHI，EcoRI，SalI）、T4连接酶试剂盒（DNA Ligation Kit）、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、核酸Marker（DL2000）大连TaKaRa有限公司；植物膜蛋白提取试剂盒 上海贝博生物有限公司；蛋白分子质量标准 北京全式金生物技术有限公司；兔抗Anti-GST抗体 北京博奥森生物技术有限公司；辣根氧化酶标记的二抗（羊抗兔IgGHRP） 西安沃尔森生物技术公司；辣根过氧化酶化学发光试剂盒 赛默飞世儿科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

DYCZ-24DN迷你双垂直电泳仪、DYCZ-40G型转印电泳仪 北京六一仪器厂；JY88-IIN超声破碎仪宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MdHB1蛋白结构预测

在NCBI数据库中搜索MdHB1基因获得其cDNA序列（GenBank：JQ678788.1），在线软件Conserved Domains Search Tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）用来预测基因的保守区域。利用DNASTAR对蛋白的二级结构及其柔韧性进行预测。蛋白三维结构同源建模在线软件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）用来构建MdHB1蛋白的三维结构。TRMHMM server v.2.0（http://www. cbs.dtu.d k/services/TMHMM-2.0/）预测蛋白的跨膜区域。

1.3.2 引物的设计与基因片段克隆

根据得到的MdHB1序列，利用Primer 5.0设计所需要的引物。设计引物MdHB1-A1（5’-CGGGATCC ATGATGGAGCCGGGCCG-3’，下划线处为BamHI酶切位点）和MdHB1-S1（5’-CGGAATTCTTATGACC ATCCCCACCAGTTCA-3’，下划线处为EcoRI酶切位点），用于连接pGEX-6p1-1载体。设计引物MdHB1-A2（5’-CCGGAATTCATGGAGCCGGGCCGTT-3’,下划线处为EcoRI酶切位点），与MdHB1-S2（5’-ACGC GTCGACTTATGACCATCCCCACCAGTT-3’，下划线处为SalI酶切位点），用于连接pET-28a（＋）载体。此外，用于检测MdHB1全长的引物为MdHB1-F（5’-AGTTGTTTAGCTGGAAAAGAGATG-3’）和MdHB1-R（5’-CAATTTAGGGGATTTAGCCATTT AT-3’）。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司负责合成。

前期，于巧平等[10]以澳洲青萍的花器为材料，从其cDNA中克隆到了苹果MdACO1的转录因子MdHB1基因。在此利用澳洲青萍的cDNA为模板，分别以MdHB1-（A1，S1）和MdHB1-（A2，S2）为引物进行基因扩增。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）体系（25 μL）为上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Es TaqMasterMix 25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃终止延伸5 min；程序进行扩增30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，利用DNA回收试剂盒回收相应大小产物。

1.3.3 原核表达载体构建

MdHB1-（A1，S1）克隆回收的DNA产物经过BamHI和EcoRI双酶切后与经过同样酶切处理的pGEX-6p-1载体相连接，得到重组质粒pGEX-6p-1-MdHB1（命名为6pHB）；同理，将MdHB1-（A2，S2）的基因克隆产物经过EcoRI和SalI双酶切后连入pET-28a（＋）载体,获得重组质粒pET-28a-MdHB1（命名为28aHB）。而后分别转入大肠杆菌感受态DH5α，经过菌液PCR和质粒PCR检测后，再通过测序验证重组载体中基因序列的正确性。

1.3.4 表达载体6pHB在大肠杆菌中的表达

提取质粒6pHB和空载pGEX-6p-1，分别转入大肠杆菌感受态BL21（DE3），挑取生长健壮阳性菌株于LB液体培养基培养。37 ℃摇床200 r/min培养菌液OD600nm至0.7～0.8后，按照终质量浓度50 mg/L的量加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导蛋白的表达8 h。离心收集菌体，移除上清液，按10 mL PBS/g菌体的量重悬菌体；利用超声破碎仪进行菌体细胞破碎，程序为：30%的能量，工作0.5 s，间歇2.5 s，破碎10 min；液氮速冻，存于－80 ℃备用。

1.3.5 MdHB1融合蛋白的可溶性分析与表达条件的优化

取6pHB阳性菌株于37 ℃、200 r/min振荡培养OD600nm至0.7～0.8，加入终质量浓度50 mg/L IPTG，混合均匀后分别取10 mL于18、28、37 ℃，200 r/min振荡培养8 h，收集，裂解菌体。再次离心，上清液存入新的离心管，沉淀中加入与上清液等体积的PBS重悬液并振荡均匀。

在28 ℃条件下，终质量浓度50 mg/L IPTG振荡培养大肠杆菌0、2、4、6、8、10 h；终质量浓度10 mg/L和100 mg/L的IPTG诱导表达融合蛋白8 h；收集，裂解菌体。

以上样品分别上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离检测。

1.3.6 表达载体28aHB的诱导表达与蛋白纯化

重组质粒28aHB在大肠杆菌中的诱导表达过程如1.3.4节中的描述基本一致。诱导6 h的28aHB菌体，12 000×g、5 min离心收集，充分裂解后，按照Novagen公司的Ni-NTA His-bind resin亲合柱的使用说明洗脱收集蛋白。并将纯化前后的蛋白，Ni-NTA柱不吸附的穿柱蛋白液等用10% SDS-PAGE分离，SDS-PAGE检测其纯化效果。

1.3.7 多克隆抗体的制备

将纯化后的蛋白样品（MdHB1-His6）作为抗原，送往上海近岸蛋白科技有限公司进行多克隆抗体制备。

1.3.8 间接ELISA法检测抗体效价

抗原以50 mmol/L酸盐包被缓冲液稀释，每孔加入量为100 ng，4 ℃过夜；5%脱脂奶粉封闭液37 ℃封闭1 h；分别加入按照1 000、4 000、8 000 倍比例稀释的抗体；37 ℃孵育1 h；洗涤，加入稀释2 000 倍的IgGHRP二抗，37 ℃孵育1 h；最后加入以四甲基联苯胺（tetramethyl benzidine，TMB）为底物的显色液，室温下暗室处理5 min，50 μL终止液（2 mol/L H2SO4溶液）终止显色，酶标仪测定酶标板各孔的OD450nm。其中以包被液作为空白对照，以免疫前的阴性血作为阴性对照。

1.3.9 Western Blot实验检测抗体的特异性

经10% SDS-PAGE分离6pHB菌株的总蛋白后，电压100 V、1 h湿转至0.45 μm的聚偏氟乙稀（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上,在含有5%脱脂奶粉的盐酸缓冲液（Tris-HCl-tween20，TBST）中4 ℃轻摇1 h封闭。用TBST稍加漂洗，分别以自制的Anti-MdHB1多克隆抗体和Anti-GST单克隆抗体为一抗，1∶2 000用TBST稀释后，置于4 ℃静止过夜。次日TBST洗涤3 次，每次10 min，再加入连有辣根氧化酶的羊抗兔IgG-HRP进行二抗孵育45 min。再次以大量的TBST漂洗3 次后，加入化学发光底物进行显色拍照。澳洲青萍幼叶蛋白的提取利用植物膜蛋白提取试剂盒，Western Blot实验操作基本与上述相同。

2 结果与分析

2.1 MdHB1的生物信息学分析

利用已经公布的MdHB1蛋白推导序列，预测蛋白的结构。保守区域预测在线软件Conserved Domains Search的结果说明MdHB1属于HD-ZipI亚家族。利用DNASTAR通过Garnier-Robson和Deleage-Roux两种方法预测MdHB1的二级结构，其结果显示各种结构所占比例大约为：α-螺旋47%，β-折叠24%，无规则卷曲20%，β-转角不超过10%；Karplus-Schulz方法预测的蛋白柔韧性区域约占整体的62.5%。利用在线三维结构预测软件SWISSMODEL形成的3D模型，其模板是人同源异形盒蛋白PRH（2m0c.1.A），两者的相似性为47.37%（图1）。此外，TRMHMM server v.2.0预测MdHB1无跨膜区域。

图1 MdHB1蛋白的生物信息学分析Fig. 1 Predicted structure of MdHB1 protein

2.2 质粒28aHB的构建

在制备抗体时，较小的标签蛋白对于制备多克隆抗体的影响更小。选用了pET-28a（＋）表达载体，其中含有His基因，诱导表达后目的蛋白中带有6×His标签蛋白（His6-tag）。纯化融合蛋白，进而作为抗原制备抗体。如图2所示，重组质粒28aHB的特异性条带明显高于空载；而在EcoRI和SalI双酶切后，在4 000～7 000 bp之间两者的特异性条带位置一致，并且重组质粒在1 000 bp左右有一条特异性条带，这与MdHB1的理论值一致。通过胶回收1 000 bp左右的条带，测序检验，确定为MdHB1序列。至此，28aHB重组质粒构建成功。

图2 重组表达载体28aHB的双酶切鉴定Fig. 2 Identification of the recombinant expression vector 28aHB by double enzyme digestion

2.3 重组质粒28aHB的表达与蛋白纯化

将28aHB载体转化至大肠杆菌感受态BL21（DE3），37 ℃、200 r/min诱导培养转菌株8 h后，离心收集，破碎菌体，SDS-PAGE上样检测。诱导后的28aHB在55 kDa处有明显的特异性条带，这比预测的融合蛋白MdHB1-His6分子质量（44.4 kDa）略高，可能的原因是由于蛋白表达过程中自身的修饰，也有可能如唐威华等[16]的研究所述，由于His6-tag的存在，降低了融合蛋白的迁移速率。破碎后的菌体离心，分离上清液与沉淀；电泳显示37 ℃诱导下，该融合蛋白绝大部分以包涵体的形式存在于沉淀中。通过Ni-NTA柱分离，洗脱，洗脱液中的融合蛋白条带明显，且只有一条明显的特异性条带，说明蛋白纯化成功（图3）。

图3 重组质粒28aHB的表达与蛋白纯化Fig. 3 Expression of recombinant plasmid 28aHB and protein purification

2.4 间接ELISA法测定多克隆抗体的效价

由图4可知，包被液（空白对照）和两个阴性对照（未免疫血）与抗原均无明显的阳性反应；而分别稀释1 000、4 000、8 000 倍的抗血清都产生了明显的反应，OD450nm都大于0.5，说明制备的多克隆抗体效果良好。

图4 间接ELISA法测定多克隆抗体的效价结果Fig. 4 Titer of polyclonal antibody determined by indirect ELISA

2.5 原核表达载体6pHB的构建

在进行多克隆抗体的特异性检测时，为了对其进行交叉检测，将MdHB1连接入另一个表达载体pGEX-6p-1（其中带有GST基因），构建6pHB载体，在大肠杆菌中诱导表达得到了MdHB1-GST融合蛋白，并优化了其的表达条件。提取重组质粒6pHB，用本实验所设计的引物MdHB1-（F，R）进行PCR验证，如图5所示，在构建好的6pHB重组质粒中克隆出了1 000 bp左右的特异性条带。BamHI和EcoRI双酶切重组质粒得到两条特异性条带，其中一条1 000 bp左右，这与验证引物克隆出的特异性条带的大小基本一致，并符合对MdHB1大小的预期；另外一条特异性条带的大小位于4 000～7 000 bp之间，这个大小与BamHI和EcoRI双酶切pGEX-6p-1空载得到的特异性条带大小基本一致。未进行双酶切的6pHB和pGEX-6p-1载体作为对照，与其双酶切结果相比，条带显示的位置都要分别低于酶切后的特异性条带，验证了环状DNA的电泳速度要快于开环DNA的结论；并且重组质粒6pHB的分子质量明显大于空载。综合以上结果，原核表达质粒6pHB构建成功。

图5 重组表达载体6pHB酶切鉴定Fig. 5 Identification of the recombinant expression vector 6pHB by double enzyme digestion

2.6 重组质粒6pHB的原核表达

重组质粒6pHB转化至大肠杆菌感受态BL21（DE3），终质量浓度50 mg/L的IPTG诱导培养8 h，离心收集菌体，裂解后上样进行SDS-PAGE。其中转入空载pGEX-6p-1的大肠杆菌作为对照，进行同样的操作。结果显示，重组质粒在66.2 kDa处有一处明显的蛋白聚集，这与预测的重组蛋白的分子大小（64.4 kDa）基本符合；空载的蛋白在25～35 kDa之间有一条明显的特异性条带，这与标签蛋白GST的蛋白分子大小（26 kDa）基本一致（图6）。这些表明，通过诱导大肠杆菌，得到了6pHB表达后带有GST-tag的融合蛋白（MdHB1-GST）。

图6 6pHB诱导表达的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis showing the induced expression of 6pHB in E. coli

2.7 融合蛋白MdHB1-GST的可溶性分析

相同质量浓度诱导剂（50 mg/L）的条件下，不同温度诱导培养转化6pHB的大肠杆菌，经过菌体破碎，离心，分离上清液，重悬沉淀，分别得到了18、28 ℃和37 ℃诱导8 h菌体总蛋白的沉淀和上清液。如图7所示，18 ℃和28 ℃的上清液中，70 kDa附近明显的特异条带明显亮于37 ℃的上清液；而三者的沉淀中所含的融合蛋白MdHB1-GST都比上清液中的量要多，37 ℃诱导下差异最为明显。这些说明该融合蛋白更多以包涵体的形式存在于沉淀中，并且较低的诱导温度（18 ℃和28 ℃）更有利于MdHB1-GST可溶性形式的表达。

图7 不同温度诱导下融合蛋白MdHB1-GST可溶性分析Fig. 7 Analysis of soluble MdHB1-GST fusion protein at different temperatures

2.8 诱导时间和诱导物质量浓度对融合蛋白MdHB1-GST表达的影响

28 ℃条件下，终质量浓度50 mg/L的IPTG诱导转化6pHB的大肠杆菌表达用以探索表达时间对蛋白表达量的影响，不同质量浓度的IPTG诱导培养8 h探索诱导物质量浓度对融合蛋白表达量的影响。经过SDS-PAGE分析，融合蛋白的表达量随着时间的延长有所增加，培养至8 h表达量基本达到了最大；而终质量浓度10、50、100 mg/L的诱导剂对于融合蛋白最终表达量影响不大（图8）。

图8 不同诱导培养时间和IPTG质量浓度对融合蛋白MdHB1-GST表达的影响Fig. 8 Effects of culture time and IPTG concentration on expression of recombinant MdHB1-GST

2.9 多克隆抗体特异性检测结果

2.9.1 菌体总蛋白的Western Blot实验

图9 菌体总蛋白的Western Blot实验结果Fig. 9 Western Blot analysis of total bacterial protein

转化6pHB的大肠杆菌诱导表达后破碎获得其菌体总蛋白，经SDS-PAGE，电湿转至PVDF膜上进行Western Blot杂交实验。1、2两条带显示，以自制的Anti-MdHB1为一抗时，在50～70 kDa之间有一条明显的特异条带，其分子质量大小符合对融合蛋白MdHB1-GST预期；3、4泳道是以兔抗Anti-GST单克隆抗体为一抗进行的杂交实验，其条带位置与多克隆抗体杂交条带是一致的（图9）。这说明多克隆抗体能够特异性的检测到融合蛋白MdHB1-GST，并且也证明了6pHB表达的融合蛋白的正确性。

2.9.2 苹果幼叶蛋白Western Blot实验

利用植物蛋白提取试剂盒提取澳洲青萍幼叶蛋白，取30 μL蛋白样品SDS-PAGE分离，转膜进行Western Blot实验。如图10所示，在70～100 kDa之间检测出一条明显的特异性条带，这与MdHB1蛋白二聚体的分子质量基本相符（38.4 kDa×2）。由此证明，自制Anti-MdHB1多克隆抗体能够从植物组织中特异性的检测到目的蛋白，且效果良好。

图10 苹果幼叶蛋白的Western Blot实验结果Fig. 10 Western Blot analysis of proteins in young apple levels

3 讨 论

本实验利用实验室前期克隆的MdHB1序列，首先利用一系列生物信息学软件对其结构进行了预测，结果表明，苹果转录因子MdHB1含有其特有的HD结构和Zip结构，是HD-ZipI亚家族的成员；两种二级结构预测方法得到的各结构所占比例基本一致，并且发现目的蛋白的柔韧性区域所占比例很高。蛋白的柔韧区域对于其功能有着很重要的作用，例如催化、结合、变构效应等[17]。当前研究表明，该家族成员多通过参与植物激素的信号转导，响应外界各种环境因素的刺激，影响植物生长发育的进程，例如水稻中，HD-ZipI亚家族成员Oshox22影响了ABA的合成，并通过ABA介导的信号转导参与水分和盐胁迫[7-9,18-22]；其较多的柔韧区域可能与这些响应有关，是各种生理响应的分子基础，正如一些研究者所认为，HD-ZipI是植物高级蛋白结构的一部分[7]。此外，预测并没有发现目的蛋白有跨膜区域；作为植物转录因子，大部分研究认为其HD-Zip家族的亚细胞定位在细胞核[6,23-24]，然而笔者最近研究发现，MdHB1的亚细胞定位不仅在细胞核，也存在于细胞膜，这可能和其自身的蛋白功能有关。

要制备高质量的抗体，理想的免疫原是前提。通过大肠杆菌原核表达目的蛋白，不仅操作简单，并且有成本低、周期短的优点。本研究构建了两种原核表达载体：6pHB和28aHB；前者带有分子质量较大的GST-tag，后者为较小的His6-tag。通过一系列的SDS-PAGE分析，探索了温度、诱导时间、诱导物质量浓度对融合蛋白MdHB1-GST诱导表达的影响。在进行兔的免疫制备抗体时，选用pET-28a（＋）载体，His6-tag分子质量小，免疫影响弱，不影响蛋白的自身活性，并且后期的纯化和鉴定也较为方便[25]。通过SDS-PAGE分析原核表达菌体总蛋白的上清液和沉淀，发现在37 ℃下，两种形式的融合蛋白大部分以包涵体的形式存在；即使在较低温度下诱导表达，MdHB1-GST可溶性融合蛋白的量有所上升，但仍然不及沉淀中包涵体的量大。一些蛋白在较低的温度下原核表达的可溶性大大增加，远超以包涵体形式存在的融合蛋白[26]，而MdHB1却达不到这样的效果，可能与其蛋白本身的结构有关。

Western Blot实验是验证特异抗体与相应蛋白互作的一种常用方法，具有反应灵敏、所需试材少等优点。通过该实验发现，自制的Anti-MdHB1多克隆抗体与菌体总蛋白杂交后，背景较低，条带清晰；也能够成功地从植物组织中成功检测到目的蛋白，且背景较低。间接ELISA表明，在抗体稀释8 000 倍的情况下，抗体OD460nm仍然较高，即所制多克隆抗体的效价较高。综上，自制得到的Anti-MdHB1多克隆抗体特异性良好，能够用于后续蛋白相关的研究。

在苹果叶片蛋白的Western Blot实验中，所得条带在70～100 kDa之间，这与预测的MdHB1的分子质量大小（38.4 kDa）相差较大，基本接近其二倍的分子质量大小。在以前的研究中，从植物体得到的成熟蛋白与预测蛋白分子质量存在差异的情况并不少[26-28]，并且从理论上讲也是极有可能的。一种可能是植物中蛋白质的修饰作用，植物体存在的蛋白不同与原核表达系统较为简单的环境，成熟的蛋白经过一系列修饰才能起作用，例如糖基化[27]；另一种是蛋白以二聚体或者多聚体的形式存在于植物组织中，多个研究表明，HD-Zip通过Zip结构域形成二聚体，然后HD结构域与特定DNA序列结合发挥转录因子的作用[29-31]，而在原核表达系统无法表现出来；故MdHB1在植物中所存在的功能形式还需要进一步的研究确定。

参考文献：

[1] ARIEL F D, MANAVELLAP A, DEZAR C A, et al. The true story of the HD-Zip family[J]. Trends in Plant Science, 2007, 12(9): 419-426.DOI:10.1016/j.tplants.2007.08.003.

[2] CAPELLA M, RIBONE P A, ARCE A L, et al. Arabidopsis thaliana HomeoBox 1 (AtHB1), a Homedomain-Leucine Zipper I (HDZipI) transcription factor, is regulated by PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR 1 to promote hypocotyl elongation[J]. New Phytologist, 2015, 207(3): 669-682. DOI:10.1111/nph.13401.

[3] LIN Z, HONG Y, YIN M, et al. A tomato HD-Zip homeobox protein, LeHB-1, plays an important role in floral organogenesis and ripening[J]. Plant Journal, 2008, 55(2): 301-310. DOI:10.1111/j.1365-313X.2008.03505.x.

[4] LÜ P, ZHANG C, LIU J, et al. RhHB1 mediates the antagonism of gibberellins to ABA and ethylene during rose (Rosa hybrida) petal senescence[J]. Plant Journal, 2014, 78(4): 578-590. DOI:10.1111/tpj.12494.

[5] CHEN C H, YIN S, LIU X W, et al. The wd-repeat protein csttg1 regulates fruit wart formation through interaction with the homeodomain-leucine zipper I protein mict[J]. Plant Physiology, 2016,171(2): 1156-1168. DOI:10.1104/pp.16.00112.

[6] GAO S, FANG J, XU F, et al. Rice HOX12 Regulates panicle exsertion by directly modulating the expression of ELONGATED UPPERMOST INTERNODE1[J]. Plant Cell, 2016, 28(3): 680-695.DOI:10.1105/tpc.15.01021.

[7] RONNY B, MARC C, XIE Y K, et al. Homeodomainleucine-zipper proteins and their role in synchronizing growth anddevelopment with the environment[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2014, 56(6):518-526.

[8] JHARRIS J C, HRMOVA M, LOPATO S, et al. Modulation of plant growth by HD-Zip class I and II transcription factors in response toenvironmental stimuli[J]. New Phytologist, 2011, 190(4): 823-837.DOI:10.1111/j.1469-8137.2011.03733.x.

[9] RÉ A, CAPELLA M, BONAVENTURE G, et al. Arabidopsis AtHB7 and AtHB12 evolved divergently to fine tune processes associated with growth and responses to water stress[J]. BMC Plant Biology, 2014,14(1): 1-14.

[10] 于巧平, 尹明安, 任小林, 等. 苹果ACO1转录因子MdHB-1基因的克隆及其真核表达载体的构建[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2012(10): 154-160. DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2012.10.026.

[11] 李兴亮. 苹果果实发育及成熟进程中乙烯发生的信号转导机制[D].北京: 中国农业大学, 2014: 48-58.

[12] 温小红, 姜永华, 周轲, 等. VIGS诱导MdHB-1沉默对苹果果实成熟的影响[J]. 西北农业学报, 2015, 24(11): 113-119. DOI:10.7606/j.issn.1004-1389.2015.11.018.

[13] 朱敏, 尹明安, 叶红红, 等. 苹果ACO1基因及转录因子MdHB-1基因的表达模式[J]. 食品科学, 2014, 35(23): 166-170. DOI:10.7506/spkxl002-663m201423033.

[14] 刘艳利, 姜永华, 王豪杰, 等. 苹果转录因子MdHB1自激活作用及其互作蛋白分析[J]. 植物生理学报, 2015(11): 1895-1900.DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2015.0347.

[15] 王豪杰, 姜永华, 刘艳利, 等. 苹果MdHB-1基因启动子中的乙烯响应元件对外源乙烯的响应分析[J]. 植物生理学报, 2016(3): 365-371.DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2015.0660.

[16] 唐威华, 张景六, 王宗阳, 等. SDS-PAGE法测定His-tag融合蛋白分子质量产生偏差的原因[J]. 分子植物(Molecular Plant), 2000, 26(1): 64-68.

[17] VIHINEN M, AL E. Accuracy of protein flexibility predictions[J].Proteins Structure Function & Bioinformatics, 1994, 19(2): 141-149.

[18] MANAVELLA P A, DEZAR C A, BONAVENTURE G, et al. HAHB4,a sunflower HD-Zip protein, integrates signals from the jasmonic acid and ethylene pathways during wounding and biotic stress responses[J].Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2008, 56(3): 376-388.DOI:10.1111/j.1365-313X.2008.03604.x.

[19] SMET I D, LAU S, EHRISMANN J S, et al. Transcriptional repression of BODENLOS by HD-ZIP transcription factor HB5 in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(10): 3009-3019.DOI:10.1093/jxb/ert137.

[20] LECHNER E, LEONHARDT N, EISLER H, et al. MATH/BTB CRL3 receptors target the homeodomain-leucine zipper ATHB6 to modulate abscisic acid signaling[J]. Developmental Cell, 2011, 21(6):1116-1128. DOI:10.1016/j.devcel.2011.10.018.

[21] ZHANG S. Function of the HD-Zip I gene Oshox22 in ABA-mediated drought and salt tolerances in rice[J]. Plant Molecular Biology, 2012,80(6): 571-585. DOI:10.1007/s11103-012-9967-1.

[22] SON O, HUR Y S, KIM Y K, et al. ATHB12, an ABA-inducible homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) protein of arabidopsis,negatively regulates the growth of the inflorescence stem by decreasing the expression of a gibberellin 20-oxidase gene[J]. Plant & Cell Physiology, 2010, 51(9): 1537-1547. DOI:10.1093/pcp/pcq108.

[23] DAI M, HU Y, MA Q, et al. Functional analysis of rice HOMEOBOX4(Oshox4) gene reveals a negative function in gibberellin responses[J].Plant Molecular Biology, 2008, 66(3): 289-301. DOI:10.1007/s11103-007-9270-8.

[24] 李明娜. 紫花苜蓿盐诱导HD-Zip类转录因子MsHB2的克隆及功能分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2014.

[25] 陈明, 徐幸莲, 周光宏, 等. 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 食品科学, 2013, 34(9): 180-184. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309037.

[26] 王琪琦, 李玉红, 胡亮亮, 等. 黄瓜CsERECTA基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 西北植物学报, 2016, 36(5): 1031-1038.DOI:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.1031.

[27] TORII K U, MITSUKAWA N, OOSUMI T, et al. The arabidopsis ERECTA gene encodes a putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats[J]. Plant Cell, 1996, 8(4): 735-746.DOI:10.1105/tpc.8.4.735.

[28] SHPAK E D, LAKEMAN M B, TORII K U. Dominant-negative receptor uncovers redundancy in the arabiadposis ERECTA leucinerich repeat recptor-like kinase signaling pathway that regulates organ shape[J]. Plant Cell, 2003, 15(5): 1095-1100. DOI:10.1105/tpc.010413.[29] FRANK W, PHILLIPS J, SALAMINI F, et al. Two dehydrationinducible transcripts from the resurrection plant Craterostigma plantagineum encode interacting homeodomain-leucine zipper proteins[J]. Plant Journal, 1998, 15(3): 413-421. DOI:10.1046/j.1365-313X.1998.00222.x.

[30] JOHANNESSON H, WANG Y, ENGSTRÖM P. DNA-binding and dimerization preferences of Arabidopsis homeodomain-leucine zipper transcription factors in vitro[J]. Plant Molecular Biology, 2001, 45(1):63-73. DOI:10.1023/A:1006423324025.

[31] MEIJER A H, SCARPELLA E, VAN DIJK E L, et al. Transcriptional repression by Oshox1, a novel homeodomainleucine zipper protein from rice[J]. Plant Journal, 1997, 11(2): 263-276.