廖建春 刘丽君 王钱道

（扬州市中医院，江苏扬州225000）

近年来，不孕不育症发病逐年上升。有资料表明，男方生殖功能异常引起不孕不育可能占40%～50%[1]，其中男性不育的主要原因可能是精子数量少、质量低，但发病机制尚未完全阐明，临床也缺乏特别有效的治疗药物[2]。现代研究发现五子衍宗方、淫羊藿和仙茅有抗氧化效应，可提高血清总超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低丙二醛（MDA），清除氧自由基和保护细胞免受损伤，从而影响精子运动功能[3-5]。五子衍宗方、淫羊藿苷可通过影响精浆中性α-葡糖苷酶或果糖从而影响精子活力和精子成熟度[6-7]。加味五子衍宗合剂是在五子衍宗方基础上加淫羊藿、仙茅等，多年来用于临床精液异常男性不育症，疗效显著。本课题组同期研究发现，加味五子衍宗合剂及其组分中药能够改善生精细胞损伤模型大鼠血清睾酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）等生殖激素水平，从而提高睾丸生精作用。本研究旨在通过测定附睾匀浆组织中α-葡糖苷酶、果糖含量，睾丸、附睾匀浆组织中MDA、SOD含量，进一步探讨加味五子衍宗合剂及其组分中药对腺嘌呤所致生精细胞损伤模型大鼠的可能治疗机制，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠80只，260～280g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 实验药物 加味五子衍宗合剂，药物组成：枸杞子12g，菟丝子12g，覆盆子12g，五味子3g，车前子6g，淫羊藿12g，仙茅6g，茯苓9g，肉苁蓉6g，巴戟天6g，制何首乌6g，当归6g，牛膝6g。五子衍宗方，药物组成：枸杞子12g，菟丝子12g，覆盆子12g，五味子3g，车前子6g。仙茅+淫羊藿药物组由仙茅6g、淫羊藿12g组成。仙茅组药物为仙茅6g，淫羊藿组药物为淫羊藿12g。枸杞子、覆盆子、当归、五味子、车前子、淫羊藿、仙茅、茯苓购自安徽惠隆中药饮片有限公司，菟丝子、肉苁蓉、巴戟天、制何首乌、牛膝购自苏州市天灵中药饮片有限公司，均为符合药典规定之正品。由扬州市中医院制剂室制备各组水提物。准确称取各药材，其中车前子布包，各药材加水提取2次，第1次加8倍量的水，浸泡0.5h，煎煮1h，滤过，第2次加6倍量的水，煎煮1h，滤过。合并2次滤液，常压浓缩至80℃下相对密度不低于1.04，常温下静置12h以上，将药液通过直管离心机，以16000r/min的速度离心，澄清液继续浓缩至80℃下相对密度不低于1.07，灭菌，分装，250mL/瓶。加味五子衍宗合剂、五子衍宗方、仙茅+淫羊藿水提物、仙茅水提物、淫羊藿水提物浓度分别为432mg/mL、180mg/mL、72mg/mL、24mg/mL、48mg/mL。

1.3 试剂 腺嘌呤：Sigma，批号WXBB0585V；果糖ELISA试剂盒、α-葡糖苷酶：上海源叶生物科技有限公司，批号分别为16042705、16042706；MDA测试盒、SOD测试盒：南京建成生物工程研究所，批号分别为20100503、20100503。

1.4 主要仪器 酶标仪，Multiskan MK3，Thermo Fisher Scientific；组织匀浆器，D-160手持式，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；分析天平，BSA124S，塞多利斯科仪器（北京）有限公司；低速台式离心机，MicroCL 17R，Thermo Fisher Scientific；水浴锅，HW-5L，郑州博科仪器设备有限公司。

2 实验方法

2.1 造模与分组 造模大鼠使用由腺嘌呤配成的浓度为14mg/mL的混悬液按20mg/100g体重灌胃，1次/d，连续4周，以出现大鼠体重减少、倦卧少动、怕冷、竖毛且毛枯无光泽、弓背蜷缩、少食多饮、小便量多等为造模成功指标[8-10]。选正常大鼠10只作为正常组，造模成功的大鼠60只按随机数目表法分为模型组、五子衍宗合剂组、五子衍宗方组、仙茅+淫羊藿水提物组、仙茅水提物组、淫羊藿水提物组，每组10只。

2.2 给药 造模成功后，除正常组、模型组给予生理盐水6mL/kg体重灌胃，各给药组按照药理学动物与人体间等效剂量换算，按6mL/kg体重给予相应的药物灌胃，每日1次，连续6周。

2.3 检测指标 末次给药后颈椎脱臼处死大鼠，取睾丸和附睾组织，用4℃ 0.9%氯化钠注射液在冰水浴中制成5%的组织匀浆，将匀浆3000r/min（4℃）离心10min，取各组大鼠睾丸和附睾匀浆上清液进行检测。按试剂盒说明书检测附睾组织中α-葡糖苷酶、果糖含量，睾丸、附睾组织中MDA、SOD含量。

2.4 统计学方法 所有数据用统计软件SPSS 20.0处理，实验数据以（±s）表示，组间样本均数采用单因素方差分析，均数两两比较采用 t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠附睾组织中α-葡糖苷酶、果糖含量比较 结果见表1。

表1 各组大鼠附睾组织中α-葡糖苷酶、果糖含量比较（ ±s）

表1 各组大鼠附睾组织中α-葡糖苷酶、果糖含量比较（ ±s）

注： 与正常组比较，**P＜0.01 ；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与加味五子衍宗合剂组比较，△P＜0.05。

组别　　动物数（只）α-葡糖苷酶（U/mL）果糖（mg/mL）正常组　10　10.81±3.60　95.88±10.28模型组　10　5.16±1.39**　89.1042±7.31加味五子衍宗合剂组　10　7.14±1.40##　109.12±13.97##五子衍宗方组　10　6.78±0.89##　99.13±20.36△仙茅+淫羊藿水提物组　10　7.30±0.86##　113.11±28.51#仙茅水提物组　10　6.18±0.42#　103.63±20.13##淫羊藿水提物组　10　6.32±0.64#　103.63±11.05#

3.2 各组大鼠睾丸、附睾组织中MDA、SOD含量比较 结果见表2。

表2 各组大鼠睾丸、附睾组织中MDA、SOD含量比较（±s）

表2 各组大鼠睾丸、附睾组织中MDA、SOD含量比较（±s）

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与加味五子衍宗合剂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与五子衍宗方组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

睾丸　　附睾MDA（nmol/mL）　SOD（U/mL）　MDA（nmol/mL）　SOD（U/mL）正常组　10　2.54±1.60　125.93±29.13　2.66±0.87　125.83±23.25模型组　10　6.94±2.73**　68.96±22.49**　9.68±2.68**　76.04±12.18**加味五子衍宗合剂组　10　4.44±1.28#　118.93±22.43##　5.32±2.62##　113.11±10.23##五子衍宗方组　10　4.42±1.16#　107.82±24.87##　6.37±2.42##　106.27±10.62##△仙茅+淫羊藿水提物组　10　4.52±1.79#　103.76±14.59##　7.31±1.84#　99.84±9.03##△△仙茅水提物组　10　5.31±1.16　102.79±11.43##　7.90±1.33　86.98±11.04#△△▲▲淫羊藿水提物组　10　5.49±1.69　90.75±20.12#△△　7.96±1.75△　89.61±21.40△△▲组别　　动物数（只）

4 讨论

男性不育病因比较复杂，大多数问题表现在少精或无精、弱精及死精症。目前发现，氧化应激在弱精症的整个发病过程中起着重要作用，过氧化物可以氧化核酸、蛋白质等，破坏细胞的完整性。MDA作为不饱和脂肪酸过氧化产物，其含量表示过氧化程度大小，是体内活性氧含量高低的指标，反映出抗氧化能力强弱，它能够抑制精子线粒体功能以及腺甘酸环化酶等多种酶的活性，进而影响精子运动功能[11]。SOD活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力[12]。病理情况下，体内自由基及MDA增多，SOD活性下降，从本实验结果可以看出，模型组大鼠睾丸、附睾组织中MDA含量明显升高，SOD含量显著降低。给药后加味五子衍宗合剂组、五子衍宗方组、仙茅+淫羊藿水提物组大鼠睾丸、附睾组织中MDA含量降低，SOD含量升高；仙茅水提物组大鼠睾丸、附睾组织中SOD含量升高，淫羊藿水提物组大鼠睾丸组织中SOD含量升高，但仙茅水提物和淫羊藿水提物组MDA含量与模型组无明显差异。说明各给药组均能提高清除自由基的酶的活性和机体抵御自由基毒性的能力。仙茅水提物组和淫羊藿水提物组大鼠MDA含量没有降低，而仙茅+淫羊藿水提物组大鼠睾丸、附睾组织中MDA含量降低，可能因为单味中药水提物对MDA影响不够，两味药协同作用才能加快MDA的清除速率，增强机体抗氧化能力。与加味五子衍宗合剂组比较，五子衍宗方组、仙茅+淫羊藿水提物组、淫羊藿水提物组、仙茅水提物组附睾组织中SOD含量降低，睾丸组织中SOD含量显著降低，附睾组织中MDA含量升高，表明加味五子衍宗合剂相对于其组分药物在提高SOD含量，降低MDA含量方面具有更好的药效。与五子衍宗方组比较，仙茅水提物组、淫羊藿水提物组附睾组织中SOD含量更低，表明五子衍宗方相对于仙茅水提物和淫羊藿水提物在升高SOD含量方面具有更好的药效。

由附睾分泌的α-葡糖苷酶，可催化多糖或碳水化合物分解为葡萄糖，参与活性精子成熟、获能及受精过程，为精子代谢和运动供能，其活性高低可直接影响精液质量，活性异常提示附睾功能障碍，是附睾的标志酶和特异性酶。精子能量的主要来源之一是精囊分泌的果糖，WHO确定测定精浆果糖可用于评价精囊腺功能，其含量反应精囊腺的分泌功能[13]。本实验结果显示，除五子衍宗方组与模型组果糖含量无显著差异外，给药组相对于模型组，大鼠附睾组织中α-葡糖苷酶、果糖含量明显增高；与加味五子衍宗合剂组比较，五子衍宗方组α-葡糖苷酶含量降低，但无显著性差异，但果糖含量则明显降低。加味五子衍宗合剂相对于其组分中药在增高α-葡糖苷酶、果糖含量方面具有更好的效果。

综上，加味五子衍宗合剂比其组分中药在改善抗氧化能力，降低氧化应激损伤方面更具优势，从而使精子活动力得到改善，其可能通过改善生殖细胞抗氧化作用和增加α-葡糖苷酶、果糖含量而提高了精子质量。下一步将探讨研究加味五子衍宗合剂及其组分中药在分子水平上是否能够上调垂体ACTH基因表达，治疗肾阳虚证，以期更全面地揭示该方治疗男性不育的机理。

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