（中南林业科技大学 风景园林学院，湖南 长沙 410004）

我国北方，由于低温的气候条件，城市园林以落叶树种为主，常绿树种较少，冬季园林景观相对南方地区较为单一。冬青属植物大多观赏价值高，适应性强，是良好的城市园林绿化树种。在欧洲和北美洲，由于其具有优良的观赏价值和较高的耐寒性，已成为当地重要的露地栽培园林绿化树种。在我国，毛志滨等[1]测定了7种冬青树种的相对电导率，计算了它们的半致死温度(LT50)，发现其耐低温能力较好。张纪林等[2]研究了11种常绿冬青的半致死温度，发现其半致死温度最低可达-23℃左右，抗寒能力强，适合向北方园林引种。曾雯等[3]通过测定丙二醛、脯氨酸和可溶性蛋白等各项指标并结合半致死温度综合评价9个杂交冬青品种的抗寒性强弱，发现抗寒性最差的‘Savannah’冬青在我国北方也能很好地露地越冬。

华中冬青Ilex centrochinensisS.Y.Hu为冬青科冬青属雌雄异株常绿乔木，又名华中枸骨，具有形态美观、叶色青翠、果实大且色泽艳丽、适应性强、观赏价值高等优良特性[4]，能够很好地弥补冬季园林景观萧条、单调的缺陷，开发利用前景广阔。

目前对华中冬青的研究仅局限于李路军[5]和林立东等[6]对其化学成分的研究和黄海燕等[7]的扦插繁殖及蒸腾耗水特性研究。田建平[8]和陈铁芳[9]对冬青属植物资源调查与种质资源评价中虽有涉及到华中冬青，但有关华中冬青抗寒性的研究报道却十分少见。因此对华中冬青进行抗寒性试验，研究低温胁迫下华中冬青雌雄株的相对电导率、丙二醛、脯氨酸、保护酶等8个生理指标的变化规律，并结合其半致死温度和隶属函数值，对华中冬青雌雄株抗寒性进行科学的综合评价，为其向北方园林的引种栽培与推广应用提供理论依据，同时也为冬青属其它植物的抗寒生理指标筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料取自湖南省长沙市沙坪试验基地的6年生华中冬青雌雄株。2016年3月（待华中冬青经过充分的低温锻炼后），选取生长健康、粗细均匀的华中冬青雌雄株木质化枝条，雌雄株单株分别采3株，每株采6个枝条共18根枝条，用湿纱布包好，迅速装入密封袋中，放入冰盒带回实验室。

1.2 低温处理

取枝条的倒二、倒三片成熟叶，清洗干净，将试材分成6组，置于5 ℃的低温恒温槽(天恒SDC-6)中预冷2 h后，进行低温试验处理。试验共设置6个温度梯度，分别为5、0、-5、-10、-15和-20 ℃，处理时间为2 h。将低温处理后的材料取出，放入5 ℃冰箱解冻12 h，测定其相对电导率和相关生理生化指标。

1.3 指标的测定

相对电导率（Rec）采用雷磁DJS-1D电导率仪测定法；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法；游离脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮显色法；可溶性蛋白（SP）含量采用考马斯亮蓝G-250法；可溶性糖（SS）含量采用蒽酮比色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑法（NBT）比色法；叶绿素含量采用丙酮提取法[10]。Logistic 方程的拟合和半致死温度（LT50）的计算参考朱海根等[11]的方法。

1.4 计算公式

（1）权重

式中：Di表示各指标对抗寒性的作用大小；i表示某一指标；Fij表示该指标在第i主成分上的负荷量；Yij表示第j主成分的贡献率；Wi表示各指标的权重。

（2）隶属函数值的计算

隶属函数值计算公式为：

反隶属函数值计算公式为：

式中：R(Xi)代表华中冬青雌雄株在某一温度处理下所对应的指标隶属度[0＜R(Xi)＜1]；Xmax指供其对应指标的最大值；Xmin指其对应指标的最小值[12]。与抗寒性呈负相关的参数Rec和MDA采用反隶属函数计算，与抗寒性呈正相关的参数SOD、脯氨酸等采用隶属函数计算。

（3）抗寒性综合指数

参照王琪和于晓南[13]的方法，根据各指标隶属度值与各指标权重，通过加乘法则计算出抗寒性综合指数I，依据其大小确定植物的抗寒性强弱。

1.5 数据的处理

通过SPSS19.0软件进行数据分析，Excel软件进行图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对华中冬青雌雄株抗寒生理指标的影响

2.1.1 低温胁迫对细胞膜透性的影响

当植物受到低温胁迫时，细胞膜会最先遭受破坏，从而使透性增大，细胞电解质大量外渗。由图1低温胁迫对华中冬青雌雄株Rec和MDA含量的影响可知，华中冬青雌雄株的变化差异不显著。随着温度的降低，华中冬青雌雄株Rec呈“S”形上升：5～0 ℃温度处理下，Rec上升平缓；在0～-5 ℃处理下急剧上升，雌株分别增加了75.10%和96.05%；-10 ℃处理后，Rec逐渐趋于平稳；在-20 ℃时，雌雄株Rec平均达到了98.97%。

MDA作为膜质的过氧化产物，其含量的变化同电导率一样，均是反映植物抗寒性强弱的重要指标。由图1可知，华中冬青雌株MDA含量在5～0 ℃时上升平缓，在0～-5℃时急剧上升，-5 ℃后趋于平缓；而雄株MDA含量在5～0 ℃时上升迅速，0～-5 ℃时上升平缓。不同温度处理下，雄株的MDA变化比雌株更为敏感，华中冬青雌雄株MDA含量差异不显著。

图1 低温胁迫对华中冬青雌雄株Rec和MDA含量的影响Fig.1 The effects of low temperature stress on Rec and MDA of I. centrochinensis

2.1.2 低温胁迫对细胞渗透调节物质的影响

SP、SS和Pro均是植物体内一种有效的亲和性渗透调节物质，当植物受到低温胁迫时，其含量均会受到一定的变化。从图2低温胁迫下华中冬青雌雄株SP和SS含量的变化中可以看出，随着温度的降低，华中冬青雌雄株SP含量呈先上升后下降的趋势，在半致死温度附近波动较大，0 ℃时达到峰值，雌雄株SP含量分别为5.57 mg·g-1和5.66 mg·g-1，雄株的下降速度明显大于雌株。华中冬青雌雄株在低温胁迫下SS的含量变化规律一致（见图2），随着温度的降低，SS含量呈先上升后下降而后上升的趋势，在0～-5 ℃时波动较大，雌雄株SS含量在-5 ℃时达到最小值，分别为21.03 和 27.30 mg·g-1。

图2 低温胁迫下华中冬青雌雄株SP和SS含量的变化Fig. 2 The changes in soluble protein and sugar contents of I. centrochinensis under low temperature treatments

Pro含量的变化趋势（见图3）与SP相似。随着温度的降低呈先上升后下降的趋势，雌株在 -5 ℃时达到峰值（206.24 μg·g-1），雄株在 0 ℃时达到峰值（172.46 μg·g-1），雌雄株分别增加了34.38%和23.69%。雌株的积累速度明显大于雄株，不同温度下Pro含量的变化差异不显著。

2.1.3 低温胁迫对保护酶活性的影响

由图4可知，低温胁迫下雌雄株SOD含量的变化差异显著，随着处理温度的降低，SOD值呈先上升后下降的趋势，雄株在0 ℃时达到峰值（535.9 U·g-1）；雌株在-5 ℃时达到峰值（581.46 U·g-1）。通过计算SOD的变化量发现，在达到峰值时，雌株和雄株的增值分别为31.87%和15.20%，雌株的增长速度大于雄株。

图3 低温胁迫下华中冬青雌雄株Pro含量的变化Fig. 3 The changes in free proline contents of I.centrochinensis under low temperature treatments

图4 低温胁迫下华中冬青雌雄株SOD活性的变化Fig. 4 The changes in SOD activities of I. centrochinensis under low temperature treatments

2.1.4 低温胁迫对叶绿体色素含量的影响

叶绿体色素的生物合成是一系列酶催化反应的结果。在低温环境下，植物叶片合成叶绿素的含量被阻，导致叶绿素含量的下降，从而影响植物的光合作用。华中冬青雌雄株叶绿体色素含量具有一定差异。由表1可知，叶绿素（Chl）随着温度的降低而下降；5～-20 ℃期间，Chl雌雄株分别下降了61.46%和69.49%，雄株的下降速度大于雌株；而类胡萝卜素（Car）的变化值很小，在0.07～0.09 mg·g-1之间，基本趋于不变的状态；雌雄株在0 ℃和-20 ℃时Chl含量差异明显，Car含量差异不明显。

2.2 华中冬青抗寒生理指标的筛选

2.2.1 抗寒生理指标的相关性分析

各抗寒生理指标间相关性差异显著。由表2低温胁迫与华中冬青抗寒性生理生化指标相关系数矩阵可知，低温胁迫与Rec和MDA呈极显著负相关，与SP和Chl呈显著正相关。随着温度的降低，华中冬青细胞膜受伤害程度增加，Rec和MDA的含量随之升高，SP和Chl含量随之降低。Rec与MDA呈极显著正相关，与SP和Chl含量呈极显著负相关，这表明低温胁迫过程中华中冬青Rec升高，MDA含量也会升高，SP和Chl含量降低。SOD活性与Pro含量呈显著正相关，说明在低温胁迫过程中华中冬青SOD活性升高，Pro含量也会随之升高。

表1 低温胁迫下华中冬青雌雄株叶绿体色素含量的变化Table 1 The changes in chlorophyll contents of I. Centrochinensis under different low temperature treatments

2.2.2 抗寒生理指标的主成分分析

对华中冬青的Rec、MDA、SOD和SP等8项生理指标进行主成分分析，根据贡献率的大小得知各生理指标的重要性。由表3华中冬青抗寒性生理生化指标主成分分析结果可知，这两个主成分的综合指标累积贡献率达到87.92%，说明前2项主成分能够充分地反映华中冬青的抗寒性情 况。其中第一主成分的特征值为4.356，贡献率为54.46%，包含了Rec、MDA、SP、SOD和Chl 5项生理指标；第二主成分的特征值为2.68，贡献率为33.463%，包括Pro、Car和SS 3项生理指标。

表2 低温胁迫与华中冬青抗寒性指标相关系数矩阵†Table 2 The indexes of cold resistance in I. centrochinensis under different low temperature treatments

表3 华中冬青抗寒性指标主成分分析结果Table 3 Results of principal component analysis of the indexes of cold resistance in I. centrochinensis

综上所述，Rec、MDA、SP、Pro、SOD等8项生理指标综合作用的结果对华中冬青的抗寒性影响显著，其中Rec、MDA、SP、SOD和Chl的贡献率最大，可作为华中冬青抗寒性鉴定的指标。

2.3 华中冬青雌雄株抗寒性综合评价

2.3.1 华中冬青雌雄株半致死温度

通过对华中冬青雌雄株的Rec计算得到Logistic方程各参数（lna、b、R2）及LT50（见表4）。华中冬青雌株和雄株的半致死温度分别为0.544和1.027 ℃，雌株的半致死温度略低于雄株。

表4 华中冬青雌雄株半致死温度（LT50）Table 4 The semi-lethal temperatures (LT50) of I. centrochinensis

2.3.2 华中冬青雌雄株抗寒指标隶属函数值

对Rec、MDA、SP、Pro、SOD等 8项生理指标的抗寒性隶属函数值进行计算，并根据相关性和主成分分析结果对各指标进行合成，获得华中冬青雌雄株的抗寒性综合指数（见表5）。雌株综合指数为0.464，雄株综合指数为0.456。综合指数越大说明抗寒性越好，根据抗寒性综合指数的大小，发现华中冬青雌雄株抗寒性强弱差异不显著，雌株略优于雄株，与LT50结果一致。

表5 华中冬青抗寒指标的隶属函数值Table 5 The membership function of the indexes of cold resistance in I. centrochinensis

3 结论与讨论

当植物受到低温胁迫时，植物体内各生理指标均会发生变化，如相对电导率、丙二醛、可溶性蛋白质、叶绿素等都与植物抗寒性有密切关系[14]。本研究通过对华中冬青的8个抗寒性生理指标进行相关性分析和主成分筛选，发现低温胁迫与Rec和MDA呈极显著负相关，与SP和Chl呈显著正相关。Rec、MDA、SP、SOD和Chl这5个生理指标的含量变化与华中冬青的抗寒性密切相关。华中冬青雌雄株抗寒性差异不显著，雌雄株LT50分别为0.544 ℃（雌株）和1.027 ℃（雄株），雌株略优于雄株，与综合评价的结果一致。

植物遭受逆境胁迫时，膜结构首先受损。王红亮等[16]以及刘霞等[17]对多种绿化树木的Rec进行测定发现，Rec与低温胁迫呈显著负相关关系。同时还有许多研究者[18]发现，通过Rec拟合Logistic回归方程能准确地获得植物组织的半致死温度，并且已经证明LT50是评价一个物种抗寒性强弱的准确指标。本研究通过此方法获得华中冬青LT50分别为0.544 ℃（雌株）和1.027 ℃（雄株），发现雌雄株抗寒性差异不显著，雌株的抗寒性略优于雄株。MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，其含量的高低与Rec同样是鉴定植物抗寒性强弱的一个重要指标[19]。MDA含量越高，叶片膜结构和功能的受冻害程度越严重，植物抗寒能力越弱[20]。本研究发现随着温度的降低，MDA含量呈“S”型变化，且与抗寒性呈极显著负相关性，与姜丽娜等[21]研究结果一致。SOD保护酶活性与植物抗寒性有着密切的关系[22]，本研究中，随着温度的降低，SOD值呈先上升后下降的趋势，雌雄株SOD值在半致死温度附近达到峰值，随后下降。而出现这种变化的原因可能是，华中冬青在逆境条件下，通过增加SOD活性来清除细胞中产生和累积的生物氧自由基使细胞免受伤害。当环境胁迫过大时，SOD活性就会降低。SP具有亲水性，它不仅可以增强细胞的持水能力，而且可以束缚更多的水分，从而减少原生质膜的损害。本研究表明，SP含量变化与低温胁迫呈显著正相关关系，在一定范围内，温度越低，SP含量越大。杨宁宁等[23]对冬油菜的抗寒性进行研究发现，SP的含量变化是影响冬油菜抗寒性的直接因素。可溶性糖是植物重要的结构物质和能源物质，其含量变化与植物的发育状况、抗性等密切相关。李鹏等[24]在研究扁桃花蕾的抗寒性时发现，SS含量随着温度的降低呈先升后降再上升的趋势，与本文的研究结果一致。Powles S B[25]提出，光合作用是植物生存的基础，也是植物受低温影响最明显的生理过程之一。叶绿体对低温反应极其敏感。本研究表明，叶绿素含量的变化随着胁迫温度的降低而下降，类胡萝卜素含量的变化基本处于不变，说明在低温环境下，植物叶片合成叶绿素的含量被阻，导致叶绿素含量的下降，而类胡萝卜素则对低温胁迫不敏感。苏敬[26]在研究常绿植物的抗寒性时也获得了相同的研究结果。

影响植物抗寒性的因素有很多，所以在研究植物抗寒性时，不能单一的从某个指标来判断植物抗寒性强弱。目前大量研究表明，通过半致死温度结合隶属函数值来综合分析植物的抗寒性，能够比较准确地判断植物的抗寒性强弱。本研究通过电导率拟合Logistic方程计算出华中冬青雌雄株的LT50，分别为0.544 ℃和1.027 ℃。结合隶属函数值综合评价发现，华中冬青雌雄株抗寒性差异不显著，雌株的抗寒性略优于雄株，与田间观测结果一致。

华中冬青向北推广的适应范围应在我国0 ℃等温线附近，大致位于秦岭—淮河一线。由于试验材料为当地品种，存在一定地域局限性，所以华中冬青在高纬度地区的具体表现还需在当地进行引种试验。同时，相对其它耐寒的冬青品种而言，华中冬青抗寒性较差，因此可以更加深入地研究如何提高华中冬青的抗寒性，为其向更高纬度地区引种以及推广应用提供可能。

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