李　蕊, 仪慧兰

山西大学生命科学学院, 太原　030006

硫是维持植物生命活动的必需元素,与植物的生长发育、逆境生理密切相关。植物可以吸收空气中的SO2作为硫营养来源,尤其在土壤含硫不足时。但大气中SO2浓度过高时,会影响植株生理。环境高浓度SO2会使叶面气孔关闭,继而影响光合作用和呼吸过程,导致植株生长发育抑制[1- 2]。SO2暴露引发植物体氧化胁迫[1],高水平活性氧(ROS,Reactive Oxygen Species)可破坏生物大分子的结构和功能,使细胞生理功能紊乱,甚至死亡[1,3- 4]；但作为信号分子,ROS还能介导气孔运动、基因转录[5- 7]等,调节植物对环境的适应。

基因转录调节是植物适应环境的基础。芯片检测发现,SO2暴露引发的拟南芥差异表达基因主要涉及细胞代谢、结合、转录调控、信号转导、物质运输等[8- 9],其中一些基因在干旱胁迫时亦发生转录应答,但植物对环境化学物SO2的响应,能否影响其干旱生理未见报道。植物对干旱的响应包括依赖脱落酸(ABA,Abscisic Acid)和不依赖ABA的两条途径,CBF4和DREB2分别是这两条途径中的关键转录因子,二者均受干旱诱导上调表达,并共同调控下游基因RD29A的表达[10- 11]。拟南芥DREB2包括DREB2A和DREB2B,均可被干旱诱导,进而激活RD29A表达,增强植物的抗旱性[10,12],DREB2A、DREB2B和RD29A转录应答是植物干旱响应的标志。热激蛋白(Hsp)是植物体内普遍存在的一类受干旱和其他刺激后大量表达的蛋白,在干旱生理中具有重要的调控作用,参与细胞内蛋白折叠、分布及降解过程,维持细胞蛋白质稳态,保护细胞免受胁迫损伤[13- 15]。气孔关闭会使叶片局部升温,但植物暴露于SO2时发生的气孔开度缩小是否能激活Hsp尚不清楚,植物对SO2的响应是否与干旱响应基因有关未见报道。

植物遭遇某种非致死性不良环境后,会增强抵御这种特定环境的能力,还能产生防御其他不良环境的能力,称为植物的交叉适应[16]。研究表明,植物对热激-干旱、低温-干旱、干旱-盐渍存在交叉适应[17- 20]。大气污染物SO2和干旱是植物遭遇的两种常见的非生物胁迫,植物对SO2和干旱是否存在交叉适应未见报道。因此,本文以模式植物拟南芥为材料,研究SO2暴露对植物干旱生理的影响,分析植株干旱生理指标与干旱响应基因表达水平的变化,探讨SO2暴露在植物应对干旱胁迫过程中可能发挥的作用。

1　材料与方法

1.1　材料准备及SO2熏气处理

取拟南芥(ArabidpsisthalianaL.)Columbia野生型种子,4℃春化2d后播种于营养土中。置于培养间培养,光照度≥3000lx,光/暗周期为16h/8h,培养温度22℃,相对湿度约60%。

取4周龄拟南芥植株,设SO2熏气组和对照组,分别置于体积0.45m3的密闭箱内,适应1d后采用静态熏气方式进行SO2暴露。根据课题组前期研究结果,浓度30mg/m3的SO2暴露72h可对拟南芥植株产生一定的生长抑制效应并诱发抗氧化防御应答[1,9],本文选用30mg/m3的SO2。根据K2S2O5+2HCl→2KCl+H2O+2SO2的原理,定量产生SO2气体,同时采用甲醛吸收副玫瑰苯胺分光光度法测定SO2浓度,使箱内浓度保持在30mg/m3。每天熏气16h,熏气期间保持光照度。

1.2　气孔开度测量

取SO2熏气6、48、72h及同期对照组拟南芥植株的第三层平展叶片,蒸馏水洗净,用透明胶带粘取非叶脉部分的下表皮,并用毛刷刷去附于其上的叶肉细胞,固定于载玻片上,光学显微镜下观察,OLYMPUS DP72数码成像系统采集图像,用软件DP2-BSW测量气孔开度。每个实验组取5棵不同植株上的叶片,每片表皮上随机选取20个视野(40×),每个视野测量10个气孔的开度。

1.3　生理指标检测

选SO2熏气3d的拟南芥与同期非熏气对照组植株进行干旱处理。将非熏气对照组植株分为干旱组(干旱)和对照组,干旱组与SO2熏气后干旱组(SO2+干旱)不再浇水,对照组适时浇水。在干旱胁迫6d时取植株地上部分,参照Ajithkumar等[21]的方法测定可溶性糖含量,参照Hao等[22]的方法测定脯氨酸和丙二醛(MDA)含量,参照李合生[23]的方法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,参照Shi等[24]方法测定叶片相对含水量。

1.4　RT-PCR分析

取SO2熏气48h和72h及同期对照组拟南芥植株地上部分,采用Trizol法提取RNA。以总RNA为模板,用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物技术有限公司)反转录合成cDNA,采用特异性引物(表1)扩增目标基因序列。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,并用Bio-Rad凝胶成像系统所带软件Image Lab分析扩增带谱的灰度值,计算基因扩增带谱灰度值和内参基因Actin2灰度值的比值,作为基因的相对表达量。

表1　RT-PCR引物序列

图1　SO2对拟南芥气孔开度的影响　Fig.1　Effect of SO2 on stomatal aperture in Arabidopsis leaves图中不同字母表示组间差异显著

1.5　数据统计分析

取3次生物学重复的平均值和标准误,F检验后,采用Duncan方法进行多重比较,分析不同处理组与对照组之间的差异显著性。图中用相同字母表示差异不显著,不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2　结果

2.1　SO2对拟南芥气孔开度及热激基因转录的影响

正常生理状态下植株叶面气孔维持一定开度及运动节律,以有效进行胞内外气体和水分的交换,满足植株的生长发育需要。30mg/m3的SO2暴露6h后拟南芥叶面气孔开度显著小于对照组,降幅为17.00%,随着SO2暴露时间的延长,气孔开度逐渐缩小,暴露72h时气孔开度降幅为24.40%,说明SO2暴露能引发拟南芥气孔关闭(图1)。

SO2胁迫诱发叶面气孔关闭,可以减少植株对SO2气体的进一步摄入。但叶面气孔开度减小,气体交换速率降低,会导致叶片内部热应激。RT-PCR检测发现,拟南芥SO2暴露48h后地上组织中热激转录因子HsfA2及其靶基因Hsp17.7、Hsp17.6B转录上调,SO2暴露72h后HsfA2及其靶基因Hsp17.7、Hsp17.6B、Hsp17.6C的转录上调幅度大于48h暴露组,均与对照组产生明显差异(图2)。结果说明,SO2能诱导拟南芥热激基因转录上调,发挥对逆境生理的调节作用。

图2　SO2对拟南芥热激基因表达的影响 Fig.2　Effect of SO2 on expression of heat shock genes in Arabidopsis shoots图中不同字母表示组间差异显著

2.2　SO2对拟南芥干旱生理的影响

从植株外形上看,干旱初期SO2+干旱组与干旱组无明显差异,随着干旱时间的延长两个干旱组间的差异逐渐增大。干旱6d后,干旱组拟南芥植株叶片萎蔫发黄,基部叶片出现枯死,而SO2+干旱组叶片萎蔫程度较轻,发黄叶片数和发黄度低于干旱组(图3),对照组、干旱组和SO2+干旱组的叶片相对含水量分别为94%、68%和78%,表明SO2预暴露能增强拟南芥植株对干旱的适应能力。

干旱6d后,SO2+干旱组与干旱组相比,可溶性糖和脯氨酸含量显著升高25.75%和112.33%,MDA含量显著降低23.62%,SOD活性显著升高26.32%(图4),表明SO2能够促进渗透调节物质的积累,提高抗氧化酶活性,降低干旱诱发的氧化损伤,进而增强拟南芥植株对干旱的适应性。

图3　SO2对拟南芥干旱胁迫植株外形的影响Fig.3　Effect of SO2 on morphology of Arabidopsis plants under drought stress

图4　SO2对干旱胁迫中拟南芥地上组织生理指标的影响Fig.4　Effect of SO2 on physiological indexes of Arabidopsis shoots under drought stress图中不同的小写字母代表组间差异显著(P<0.05)；SO2 +非干旱组与非干旱对照组无显著差异;A： 对照Control；B：干旱Drought；C：SO2 +干旱SO2 + drought;SOD：超氧化物歧化酶superoxide dismutase；MDA：丙二醛malondialdehyde

图5　SO2对拟南芥干旱响应基因表达的影响Fig.5　Effect of SO2 on expression of drought-responsive genes in Arabidopsis shoots图中不同字母表示组间差异显著

2.3　SO2对拟南芥干旱响应基因转录的影响

为分析SO2暴露与植物干旱胁迫应答的关系,检测了SO2对拟南芥干旱响应基因转录的影响,发现干旱响应转录因子DREB2A、DREB2B及其下游基因RD29A在SO2暴露组均表达增强(图5),表明SO2能提高拟南芥干旱响应基因的表达量,从而调节和增强植株对干旱的适应能力。

3　讨论

气孔调控着植物与外界环境之间的气体与水分交换,在植物的生命活动中发挥着重要作用。大气SO2浓度较高时植物叶面气孔开度减小,以减少对SO2的吸收,但却影响了叶片的气体交换速率和蒸腾作用,引起叶片组织细胞温度升高。热刺激能诱导植物Hsp表达增强,其中小分子热激蛋白(sHsps)对逆境适应具有重要作用。sHsps可修复受损蛋白,参与胞内蛋白折叠、分布及降解过程,维护蛋白质稳态；sHsps参与对氧化胁迫的响应,能调节基因转录,提高植物逆境适应性[13- 15,25- 26]。拟南芥热激转录因子HsfA2及其靶基因Hsp17.7、Hsp17.6B、Hsp17.6C在SO2熏气组转录上调,可促使其编码蛋白的水平升高,继而对干旱等相关的逆境生理过程发挥积极的调节作用。SO2暴露时间延长时这些热激基因上调幅度增大,可能与SO2暴露期间持续的气孔关闭导致热胁迫增强有关。

干旱条件下植物会主动积累脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质,通过调节细胞渗透势、提高细胞保水能力、维持细胞膨压等使植株得以在干旱条件下生存[24]。研究发现,SO2+干旱组拟南芥的萎蔫程度低于单纯干旱组,植株相对含水量、脯氨酸和可溶性糖含量均显著高于单纯干旱组,说明SO2能促进植物细胞合成和积累更多的渗透调节物质,从而提高干旱条件下细胞的渗透调节能力,减少干旱期间植株的水分散失,提高逆境适应性。渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等参与介导植物对低温-干旱、干旱-盐和热激-干旱的交叉适应[17- 20],本研究表明渗透调节物质在植物对SO2-干旱交叉适应中同样具有重要作用。

根据前期研究结果[1],本研究选用一定的SO2暴露方式促使拟南芥植株产生抗氧化防御应答,导致了后期的干旱适应性提高,及干旱期间抗氧化酶SOD活性升高和膜脂氧化产物MDA水平下降,说明SO2激活细胞抗氧化能力在介导植株干旱适应过程中发挥了重要作用。SO2激活拟南芥抗氧化酶,可有效降低干旱引发的氧化胁迫,减轻细胞氧化损伤效应,使MDA含量降低。该结果与郭丽红等报道的抗氧化酶参与介导玉米幼苗交叉适应性的结果[27]相似,说明抗氧化酶活性提高是植物交叉适应性产生的重要基础。

为进一步证实SO2可诱发植物对干旱的适应,本文检测了拟南芥干旱响应基因DREB2A、DREB2B和RD29A的转录水平,证实SO2能使拟南芥DREB及其靶基因RD29A上调表达。因此,拟南芥干旱响应基因转录的改变为SO2诱发植株干旱适应性提高提供了直接的证据。有报道称DREB2A参与调节植株失水和热胁迫应答[28],本研究中SO2诱导的气孔关闭及由此引发的热胁迫可能是DREB转录应答的重要诱因。

高浓度SO2使植物气孔关闭、抗氧化酶活性提高、抗氧化防护基因转录应答[1,8- 9,29],不仅产生了对SO2的适应,还介导了植株对干旱的适应性提高,出现了交叉适应。SO2胁迫使植物体内ROS水平升高[1,3],而ROS升高可介导拟南芥HsfA2和Hsps转录上调[30],诱发DREB2转录应答[10],因此ROS应该是SO2和干旱胁迫共同的信号分子。作为信号分子,ROS参与调节植物生长发育和逆境适应,并参与植物的交叉适应[16- 17],但有关调节机制有待进一步深入研究。

本文结果与之前发现的SO2衍生物预处理提高干旱条件下小麦种子萌发率、增强谷子幼苗干旱适应性[31- 32]的结果相似,其中均涉及SO2诱导的植株抗氧化酶活性增强,渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖等含量提高,表明这些过程参与介导植物的干旱适应性。本文发现SO2能诱发植物干旱响应转录因子DREB2及其靶基因RD29A、热激转录因子HsfA2及其靶基因sHsps的转录应答,为SO2介导干旱适应性产生提供了新的证据。但交叉适应性产生可能涉及植物细胞内包括信号识别、基因转录调控、代谢改变等众多环节,详细机制有待进一步的研究。植物生存期间会面临多种环境刺激,适应复杂多变的环境条件是植物生存的必须,而交叉适应性的出现是植物适应环境的一条有效途径。本结果揭示了植物对大气污染物和干旱的交叉适应性,为同类研究提供了新的实验依据。

4　结论

植物暴露于大气中较高浓度的SO2时,通过气孔关闭减少对SO2的进一步摄入,而基因转录应答从根本上调节着植物对环境的适应。30mg/m3的SO2能诱导植物气孔关闭,使热激基因转录,干旱响应基因激活,抗氧化能力提高,这些改变为植物应对干旱环境提供了基础条件。SO2预暴露能促进植株干旱生理期间积累更多的渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖,使叶片相对含水量显著高于单纯干旱组,植物的干旱适应性得以增强。拟南芥植株在SO2预暴露后对干旱的适应性提高,说明植物对SO2和干旱产生了交叉适应。

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