张　乐，刘　超，翁丽萍

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州　310024)

目前，随着人们生活水平的提高，对各类水产品的消费量日益增大，但水产养殖及运输等过程中违规用药的事情层出不穷，且使用的药物种类繁多，这些兽药的滥用乱用给消费者健康带来了极大地隐患。目前已报道的水产品中药物残留主要有磺胺类[1-4]、喹诺酮类[5-10]、四环素类[11-14]、硝基咪唑类[15]、大环内酯类[16-17]等抗生素，以及激素类[18-21]等药物。

目前水产品中抗生素及激素类药物残留监测主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、酶联免疫及胶体金法等，但抗生素类及激素类药物种类繁多，仅抗生素临床使用的就近千种，若想筛查出影响质量安全的具体药物，需要投入巨大的人力物力进行一系列检测试验，成本巨大且周期很长。

高分辨筛查技术可提供质量范围内目标物的精确质量数，具有选择性高、受干扰小、扫描速度快等特点，而在药物筛查方面受到越来越多的关注。张晓光等[22]利用超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查保健品中23种非法添加西药成分。严凤等[23]利用超高效液相色谱一四级杆一静电场轨道阱高分辨质谱筛查测定饲料中19种磺胺类药物，但利用静电场轨道阱高分辨质谱高通量筛查水产品药物残留国内未见报道。

本研究通过建立Q-E质谱筛查信息库，并建立超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱筛查水产品中62种药物残留的方法，达到快速准确筛查的目的。

1　材料与方法

1.1　仪器和试剂

仪器有Q-Exactive超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(美国ThermoFisher公司)，MS204电子天平(瑞士梅特勒公司)，Eppendorf5810R离心机(德国Eppendorf公司)，氮吹仪(OrganomationN- EVAP-24)，Hei-VAPPrecision全自动旋转蒸发仪(德国，海道尔夫)。

标准品：萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、西诺沙星、吡哌酸、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星、加替沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、甲氧苄啶磺胺喹恶啉、磺胺多辛、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡啶、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、美他环素、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奥硝唑、克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、罗红霉素、甲基睾酮、炔诺酮、醋酸氯地孕酮、左炔诺孕酮、利福平、氨苄西林、头孢拉定(德国Dr．Ehrenstofer公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵(色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2　标准溶液的配置

准确称取上述标准品12.5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，得到浓度为500 μg·mL-1的单标准储备液，置于-18 ℃冷冻保存。使用时用30%乙腈溶液稀释至所需浓度的单标或混标。

1.3　样品前处理

5 g样品，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，超声5 min，涡旋1 min，4 000 r·min-1离心10 min，取出上清液，残渣再用10 mL0.1%甲酸乙腈提取1次，合并提取液35 ℃旋转蒸发干，2 mL溶解液溶解，过0.2 μm滤膜，上机测定。

1.4　仪器条件

1.4.1色谱条件

色谱柱：AcquityUPLCBEHC18，2.1 mm×150 mm，1.7 μm。流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸+2 mmol甲酸铵；梯度洗脱，洗脱程序：0～2 min，5%A；2～8 min，5%～30%A；8～15 min，30%～95%A；15～17 min，95%A；17～20 min，5%A；流速0.3 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量5 μL。

1.4.2质谱条件

正离子扫描，分辨率70 000，毛细管电压3.2 KV，离子传输管温度320 ℃，气化温度350 ℃，鞘气压40 arb，辅助气压10 arb，一级质谱驻留时间100 ms，二级质谱驻留时间50 ms，一级全扫描范围m/z60～850，扫描模式Funscan+ddms(一级全扫描+自动触发二级质谱扫描)，碰撞能量为(40±60)% eV。

2　结果与分析

2.1　筛查数据库的建立

取合适浓度的标准品溶液，在上述质谱条件下进行扫描，得到目标物的准确荷质比，然后进行二级质谱扫描，得到目标物的二级质谱扫描图和离子碎片信息，最后在优化的色谱条件下进样，得到目标物的保留时间信息，根据上述信息建立62种药物的筛查信息数据库(表1)。

对比一级母离子的理论和实测结果的m/z，偏差范围在0.02～1.74×10-6，符合高分辨质谱定性的质量准确度误差5×10-6以内的要求。

2.2　样品提取与色谱条件的选择

样品提取液测试了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸甲醇等几种，通过添加回收比对，选取0.1%甲酸乙腈作为提取剂。

在色谱条件方面，测试了不同色谱柱(HypersilGold C182.1 mm×100 mm，1.7 μm；ACQUITYUPLCHSST 32.1 mm×100 mm，1.7 μm；ACQUITYUPLCBEHC18 2.1 mm×150 mm，1.7 μm)、不同流动相(乙腈-0.1%甲酸体系；乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1甲酸铵体系)及不同流动相梯度的情况。T3柱分离喹诺酮类药物峰形拖尾，其他几种条件对大部分物质分离良好，但几组同分异构体分不开，最后通过测试选择1.4.1的条件。上述条件下，目标物响应良好(图1)，各组同分异构体分离度和峰形均达到较满意的结果，见m/z=311.1同分异构体磺胺多辛和磺胺间二甲氧嘧啶(图2),m/z=281.1同分异构体磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺6-甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪(图3)，m/z=445.2同分异构体四环素和强力霉素(图4)。

图1　全扫描的结果

图2　m/z=311.1同分异构体的色谱

表1　药物筛查的信息

图3　m/z=281.1同分异构体的色谱

图4　m/z=445.2同分异构体的色谱

2.3　检出限与回收率

根据检测限信噪比>3，定量限信噪比>10的要求，确定本方法的检出限10 μg·kg-1。在淡水鱼、甲鱼两种基质中分别添加20、200 μg·kg-1浓度水平的混合标准溶液进行回收实验，回收率范围在48.3%～105.8%。部分药物回收率偏低，可能因为基质效应，以及前处理方式还有改进空间，但本研究作为一个高通量的快速筛查方法，主要是定性的准确性，定量可通过后续三重四极杆液质进一步验证确认。

2.4　实际样品检测

应用本研究建立的方法检测筛查了12批次水产样品，其中一批次淡水鱼样品筛查出恩诺沙星，结果与三重四级杆液质检测结果接近。

3　小结

本研究建立了超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱筛查水产品中药物残留的方法，在20 min的内完成62种药物的筛查确证。方法具有质量精度高、前处理简单、快速的特点，达到快速高通量准确筛查水产品药物残留的目的。

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