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IL-1β激活p38 MAPK通路促进人颞下颌关节滑液间充质干细胞分泌IL-6和IL-8

2018-04-12刘文静孙养鹏郑有华王周涛张志光

实用口腔医学杂志 2018年2期
关键词:滑液下颌炎性

刘文静 孙养鹏 郑有华 王周涛 张志光

颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorder,TMD)可引起关节区或颌面部疼痛、颞下颌关节弹响和下颌运动障碍等,严重时可影响患者的生活和工作。滑液在维持关节的正常生理功能中发挥着十分重要的作用。对滑液中的不同介质、促炎因子和自由基等的表达和改变一直在TMD发病机制的研究中备受关注。

前期研究中我们发现从TMD患者颞下颌关节滑液可分离培养获得间充质干细胞,并与滑液中存在的滑膜碎片培养获得的间充质干细胞进行比较研究发现他们具有相似的间充质干细胞特征,推测滑液间充质干细胞(synovial fluid derived mesenchymal stem cells,SFMSCs)极有可能来源于滑膜,与滑膜成纤维细胞密切相关[1]。

然而,颞下颌关节内存在的自体干细胞在TMD中为什么启动自行修复组织再生的能力有限?随着TMD病程的发展发生组织破坏、关节盘穿孔,其复杂的炎性内环境和异常的内压力可能使SFMSCs进行组织修复再生的机制更为复杂。因此本研究拟以IL-1β刺激SFMSCs,模拟TMD关节内微环境,检测SFMSCs及细胞培养基中IL-6和 IL-8的表达情况及p38 MAPK炎症通路的影响,为探讨SFMSCs在关节致病机制中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清、α-MEM细胞培养基、GlutaMAX(Gibco,美国);rhIL-1β(PeproTech,美国);p38 MAPK抑制剂 SB-203580(Santa Cruz Biotechnology,美国);LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche,美国);RIPA裂解液(Cell Signaling Technology,美国);Protease Inhibitor Cocktail Tablets、Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets(Roche,美国);兔抗p-p38抗体、兔抗p38抗体、羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology,美国);小鼠抗GAPDH抗体(杭州联科生物技术股份有限公司);PVDF膜(Millipore,美国);总RNA提取试剂盒(Promega,美国);Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit、LightCycler®480 SYBR Green I Master(Roche,美国);CBA炎症因子检测试剂盒(BD,美国);流式细胞仪(Beckman Coulter,美国);电泳系统(上海天能公司)。

1.2 SFMSCs细胞培养

颞下颌关节滑液样本来源于中山大学附属口腔医院颞下颌关节门诊就诊的TMD患者19例,年龄16~57岁,其中男4例,女15例。纳入标准:患者未接受过非甾体类抗炎药物,肌松剂等或其他药物治疗,且无特异性炎症,类风湿关节炎、外伤史或肿瘤等其他全身系统性疾病患者。患者因TMD诊疗需要进行关节灌洗术,术后获得的灌洗液样本进行体外培养获得原代SFMSCs[1],混合后进行传代扩增。本实验已获广州中山大学附属口腔医院医学伦理委员会批准(口腔[2016]伦审第(18)号),所有参与研究的患者均已签署知情同意。

1.3 LDH细胞毒性检测

取96孔板,按Roche LDH细胞毒性检测试剂盒操作手册将空白对照(培养基)组、阴性对照组、阳性对照组、实验组(分别加入处理因素IL-1β10 ng/ml和SB-203580 10μmol/L)加入96孔板,每组3个复孔。各孔加入100μl反应混合液避光30 min后加入终止反应液50μl混匀10 s后,酶标仪检测490 nm波长吸光度值。对 IL-1β10 ng/ml和 SB-203580 10μmol/L处理因素下SFMSCs细胞毒性进行分析。

1.4 蛋白免疫印迹p38 MAPK信号蛋白检测

SFMSCs细胞按500个/cm2的浓度接种于6孔板中,在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养6 d,更换完全培养基。分为对照组 (IL-1β0 ng/m l)和IL-1β处理组(加入IL-1β10 ng/ml 2 h)。将2组细胞去除培养基,加入含有酶抑制剂的RIPA裂解液100μl,在冰上充分刮取裂解30min,4℃离心(12 000 g离心30 min),取上清提取蛋白。BCA蛋白定量计算待测样品中的蛋白浓度。蛋白上样后SDS-PAGE凝胶电泳分离后转膜,转膜好的PVDF膜用PBST稍洗后室温下在脱色摇床上于5%BSA封闭液中室温封闭1 h。一抗(兔抗人p38,1∶1 000;兔抗人p-p38,1∶1 000;小鼠抗人GAPDH,1∶2 000),4℃冰上摇床孵育过夜,PBST室温下脱色摇床上洗。二抗室温孵育1 h,PBST室温下脱色摇床上洗。取出膜浸入已配好的ECL发光液中反应3 min后于化学发光成像分析系统中曝光成像并摄片。用Image J图象分析软件测定目的条带的光密度值,并以p38的光密度值为参照进行校正。

1.5 SFMSCs各组细胞IL-6和IL-8基因检测

SFMSCs细胞按500个/cm2的浓度接种于6孔板中,在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养6 d,更换完全培养基。分为 3组,分别为对照组(IL-1β0 ng/ml)、IL-1β处理组(加入 IL-1β10 ng/ml 2 h)和p38 MAPK抑制剂组(预先加入SB-203580 10μmol/L 1 h后,加入IL-1β10 ng/ml 2 h)。按时间点提取细胞RNA,逆转录合成cDNA。采用荧光定量qPCR检测方法检测基因IL-6和IL-8的表达情况。引物序列见表1。应用2-ΔΔCt计算基因的相对表达水平,其中以GAPDH作为内参基因,并计算扩增效率。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

表1 RT-PCR中待测基因的引物序列Tab 1 Primers used in RT-PCR

1.6 SFMSCs细胞因子分泌检测

取经过处理所得各组细胞的培养基,低温离心3 000 g 10 min,各待测样品取50μl分别放置各待测管中。将IL-6、IL-8捕获微球充分涡旋混匀并混合后,每一检测管中各加入50μl混合捕获微球液;在每一个受测试管中加入人IL-6、IL-8PE检测混合试剂各50μl;所有测试管在室温避光孵育3 h,所有检测管中加入850μl洗液,然后离心200 g,5 min,吸出上清重新加入1 ml洗液,悬浮微球。置入流式细胞仪中检测各组待测样本中细胞因子IL-6和IL-8的分泌量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件分析,应用方差分析对各组进行比较,以P<0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 处理因素细胞毒性检测

对培养扩增获得的SFMSCs进行刺激因素细胞毒性检测。记录96孔板各组测得490 nm吸光度值,根据公式:细胞毒性(%)=(实验处理组吸光度值-阴性对照吸光度值)/(阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值)。测得IL-1β10 ng/ml处理组细胞毒性为0.11%,SB-203580 10μmol/L处理组细胞毒性为0.47%。结果显示刺激因素处理对SFMSCs基本无毒性,可以继续进行相关实验。

2.2 SFMSCsp38 MAPK蛋白Western Blot检测分析

实验通过Western blot检测发现p-p38 MAPK蛋白在IL-1β处理组明显较对照组表达增强。以p38总蛋白的光密度值为参照进行校正,显示IL-1β处理组蛋白表达量约为对照组3.60倍(图1)。

图1 2组间SFMSCs细胞p38 MAPK信号蛋白表达检测Fig 1 Western blot analysis of p38 MAPK in the 2 groups

2.3 SFMSCs中IL-6和IL-8基因表达检测

通过RT-PCR检测比较显示IL-1β刺激下SFMSCs IL-6和IL-8基因的表达明显升高(P<0.05),分别为61.42±2.23和 61.13±2.11。应用 p38 MAPK抑制剂SB-203580组SFMSCs IL-6和IL-8基因表达水平明显下降,IL-6和IL-8基因表达水平分别为13.65±0.57和18.85±0.15(图 2)。

图2 各组SFMSCs细胞因子基因表达分析(*:与对照组比较,P<0.05;#:与IL-1β组比较,P<0.05)Fig 2 Gene expression of IL-6 and IL-8 in different groups(*:vs control group,P<0.05;#:vs IL-1βgroup,P<0.05)

2.4 SFMSCs炎性细胞因子分泌的CBA检测分析

CBA检测SFMSCs培养基中炎性细胞因子的表达发现SFMSCs可以分泌IL-6和IL-8,并在IL-1β刺激后IL-6和IL-8的含量持续增加,分别达到对照组的5.67倍和7.99倍。p38 MAPK抑制剂预处理组则显示p38 MAPK抑制剂可部分抑制IL-6和IL-8的分泌,该组培养基中IL-6和IL-8的分泌量分别为对照组的1.86倍和3.32倍,进一步证实p38 MAPK信号通路参与IL-1β介导的SFMSCs细胞炎性分泌(图3)。

3 讨 论

IL-1β是由单核巨噬细胞分泌,在IL-1家族中起关键作用的因子。在正常颞下颌关节滑液中IL-1β含量很少[2],而在骨关节病患者的关节液中IL-1β浓度升高,且随着TMD病程的进展,IL-1β的表达持续增高[3]。因而被认为是颞下颌关节炎症及关节组织损害发生发展中最重要的炎症因子之一。IL-1β不仅主要分布在颞下颌关节骨关节病的滑膜衬里细胞层,同时也在关节盘及关节滑液中高表达。近来研究进一步发现IL-1β还是连接关节炎症和血管再生的关键分子,可以促进颞下颌关节盘组织细胞分泌血管生成因子,刺激新生血管组织中MMPs基因过度表达,从而加速关节盘和髁突软骨的降解[4]。前期研究中我们采用维生素B12作为内对照,对颞下颌关节滑液中IL-1β的分泌水平定量检测发现正常志愿者关节滑液中几乎检测不到或含有微量的IL-1β,而TMD患者关节滑液内IL-1β的含量与其关节紊乱指数(Friction dysfunction index,DI)呈中等程度相关[3]。因此本实验中选用IL-1β作为刺激因素进行初步探索。

图3 各组SFMSCs细胞培养基CBA检测Fig 3 Cytokine secretion by SFMSCs in different groups examined by CBA

间充质干细胞能够向损伤部位趋化并可自我更新多向分化进行组织修复,使其成为口腔疾病治疗与组织修复的新热点[5]。越来越多的研究也关注到MSCs的旁分泌功能在抗炎和修复如肺损伤[6]、肾疾病[7]、心肌梗塞[8]、中风[9]或骨组织再生[10]中扮演的重要角色。但是,仍有其他因素可以改变逆转这些特性从而发挥促炎作用。如BMSCs高表达Toll样受体TLR-3和TLR4,它们与配体结合后下调Notch配体Jagged-1,继而影响其免疫抑制能力[11]。不同组织来源的MSCs还可在炎性因子TNF-α或IFN-γ的刺激下产生其他炎性细胞因子,上调趋化因子受体和IDO表达,从而影响其免疫抑制作用和MSCs迁移[12-13]。在急性炎症的环境下,MSCs分泌增多的细胞因子可对局部微环境的炎性因子产生刺激作用,使得T细胞反应和B细胞活性上调。MSCs还可在低浓度IFN-γ刺激下通过表达II型主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)发挥抗原呈递作用,而随着 IFN-γ水平的增加,MHC-II表达则减少,从而加重炎症反应[14]。目前关于局部炎性因子刺激对MSCs特性的影响多关注在骨髓间充质干细胞,然而不同微环境中MSCs分泌生物活性因子不同[15-16],不同组织来源的间充质干细胞其转录本、蛋白表达及分化潜能都不同。Djouad等[17]研究报道BMSCs表达较高的神经调节蛋白、胰岛素样生长因子2、OX40L和激活素A,滑膜来源的MSCs则不同于BMSCs而表达较高的MIP2-α、IL-6和IL-8转录水平。因此进一步了解SFMSCs的免疫分泌特性对临床应用治疗颞下颌关节疾病及组织修复有重要的意义。

本实验结果显示IL-1β刺激下SFMSCs及其培养基中IL-6和IL-8的表达情况均明显增加。在关节疾病的发病机制中已证实促炎因子如IL-6、IL-8、干扰素γ、单核细胞趋化蛋白是促进骨关节炎的炎症发展过程的重要因素[18]。炎症化的SFMSCs可分泌炎性因子IL-6和IL-8,可能是TMD中一重要的炎性靶细胞。那么,IL-1β调节SFMSCs炎性因子分泌的作用机制,则可能是关节疾病中的另一重要致病机制。

MAPK信号通路在各种细胞生物学活动中都有至关重要的作用,它包括ERK、JNK和p38信号通路。大量的文献研究中已经证实p38 MAPKs是参与调控炎症反应的重要机制,在炎性介质如趋化因子、细胞因子或生长因子刺激下激活相应受体,从而产生一系列细胞生物学反应[19]。因此本研究中通过 Western blot检测发现在IL-1β刺激下,p-p38 MAPK蛋白表达明显增强,进一步通过p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580作用下SFMSCs细胞基因和培养基中细胞因子含量证实抑制p38 MAPK可明显影响IL-6和IL-8的表达和分泌,尤其是IL-6。有研究显示IL-1β可通过活化p38 MAPK诱导髁突软骨细胞凋亡[20]。因此,IL-1β可能通过p38 MAPK信号通路促进SFMSCs分泌IL-6和IL-8,并参与介导关节软骨破坏。

对炎性微环境下 SFMSCs的炎性分泌及 p38 MAPK信号通路作用的研究可能为探究颞下颌关节紊乱病中的炎症及其引发骨关节退行性改变和功能障碍的免疫分子机制提供新的靶点。

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