宋 迎,鲁 芳,严孝金,张 蓓,刘 永,张 立,孟 昆,杨培龙,姚 斌,高 伟*

1.北京林业大学理学院,北京 100083 2.中国农业科学院,北京 100081

木聚糖是半纤维素类的代表性组分，在自然界中，其含量仅次于纤维素，属于第二大丰富的多聚糖。木聚糖广泛存在于农业副产品中，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖酶（Xylanase）属于水解酶类，能够将木聚糖降解为木糖和低聚木糖[1]，在食品、饲料、制浆造纸等行业具有重要的应用价值。在食品生产过程中，作为一种功能性食品添加剂被广泛应用[2]；在饲料中添加酶制剂可以改善其营养价值[3]；在制浆造纸工业中，可以应用木聚糖酶进行纸浆预漂白、高纯度纤维素浆精制、废纸脱墨和改善纤维性能等有意义的工作[4]，因此对木聚糖的有效利用和深层开发已成为国内外的研究热点。

木聚糖酶来源广泛且结构复杂，本文所研究的木聚糖酶XynB-E18属F/10家族[5,6]，该家族木聚糖酶基因在真核、原核生物中均得到成功表达。目前从芽胞杆菌属、木霉属、曲霉属、青霉属、乳杆菌、假丝酵母菌菌株中得到嗜碱性木聚糖酶；从里氏木霉、白曲霉、酵母类真菌、青霉属分离到嗜酸性木聚糖酶，其中黑曲霉和里氏木霉木聚糖酶研究较为深入；从热解纤维素果汁杆菌属、海洋红嗜热盐菌、脂肪嗜热芽孢杆菌、嗜热子囊菌、热纤梭菌等嗜热和超嗜热微生物中分离得到热稳定性的木聚糖酶，其中来源于海栖热袍菌的XynA是已报道的嗜热性最高的酶，最适温度105℃。在结构上F/10家族木聚糖酶均含有保守“TIM桶”结构，具有催化木聚糖和葡聚糖水解的活性，故又可将木聚糖酶XynB-E18称之为双功能酶，该特性有利于对其酶活性质的研究[7]。从酶的分子量上划分，可将木聚糖酶分为低分子量木聚糖酶（182～234个氨基酸残基）和高分子量木聚糖酶（269～809个氨基酸残基），木聚糖酶XynB-E18分子量在38kDa左右，属于高分子量蛋白，便于分离和纯化[8-10]。本研究中的木聚糖酶XynB-E18来自富含纤维素和半纤维素的青贮饲料菌群[11]，各方面性能良好，便于研究。实验通过体外重组的方法对其进行高效表达和分离纯化，并进行酶学性质研究，通过分析酶活特性，进一步推测其结构上的特性，为最终晶体学研究提供理论基础，也为今后从分子水平研究该酶的反应机理提供理论依据，以便开发更加适合工业生产，满足人民生活需要的新酶。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒XynB-E18来自玉米青贮饲料[12,13]含重组质粒pET28b(+)-XynB-E18的大肠杆菌BL21感受态细胞由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司；IPTG购自美国Merck公司；卡那霉素、Tris-HCl购自美国Amresco公司；蛋白标准品购自加拿大MBI Fermentas公司；Ni亲和层析填料Ni Sepharose 6 Fast Flow，凝胶过滤层析柱Superdex 200 10/300 GL购自美国GE Healthcare公司。

1.1.3 主要仪器设备 恒温震荡摇床购自上海苏坤实业有限公司；小型离心机购自上海安亭科学仪器厂；冷冻高速离心机购自美国Sigma公司；大型冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机有限公司；超生破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；超纯水仪、静音混合器购自美国Millipore公司；紫外分光光度计购自美国Beckman-coulter公司；高效液相层析系统购自美国GE Healthcare公司。

1.1.4 DNS试剂的配置[14]称取182g酒石酸钾钠溶于500mL热水中，向其中加入16g氢氧化钠，搅拌至溶解，再称取5.0g 3,5-二硝基水杨酸、5.0g结晶酚和亚硫酸钠，加入混合液中不断搅拌，至完全溶解，蒸馏水定容至1000mL，储存于棕色瓶中，避光保存，室温下放置7 d后使用。

1.2 方法

1.2.1 序列对比分析 使用蛋白质数据库（Protein databank,PDB）搜索相关序列，与已解出结构的蛋白质进行序列比较，参考Identities数值的大小，选取三个与XynB-E18蛋白最相似的蛋白进行结构上的比较。

1.2.2 重组质粒pET28b(+)-XynB-E18的原核表达[15]将带有重组质粒的BL21菌株接种于2个小试管,每管中有5mL LB培养基(含50µg·mL-1卡那霉素)，在37℃的温度下、以200r·min-1的速度恒温震荡12 h，待菌株摇起后将菌液接种至1000mL的LB液体培养基中进行扩大培养，在同样的条件下恒温培养6～8h，检测OD600值达到0.6～0.8之间时，将培养箱内温度调整到16℃、180 r·min-1继续培养，待培养基温度完全降至16℃左右，加入200µL浓度为1 mol·L-1的IPTG溶液，对其进行过夜的诱导表达，诱导时间在14 h左右。次日取出诱导后的菌液，将其置于低速冷冻离心机中离心处理30 min，条件为4℃,4000 r·min-1。待菌体与培养基完全分离之后，倒掉液体培养基，向沉淀的菌体中加入悬浮缓冲液将其重悬（20mol·L-1Tris pH 8.0,500mol·L-1NaCl,15%甘油），将菌液转移到50 mL的聚丙烯离心管中，冰浴10 min之后使用超声破碎仪进行细胞破裂，工作3 s间歇7 s重复100次。将裂解过后的菌液放置于高速离心机中，在4℃，13000r·min-1的条件下离心处理30 min，使菌体与裂解上清完全分离，并将离心后的上清转移到离心管中。

1.2.3 XynB-E18蛋白的分离纯化[16]吸取Ni亲和层析填料5mL并组装好层析柱，分别用10倍柱体积的超纯水和5倍柱体积的上样缓冲液冲洗平衡层析柱（20mol·L-1Tris pH7.5 500mol·L-1NaCl），待层析柱平衡完成后，将超声破碎的上清全部缓慢通过Ni柱，然后用上样缓冲液冲洗杂蛋白至紫外分析仪上的示数降至0附近，分别用10mol·L-1、50mol·L-1、250mol·L-1梯度浓度的咪唑洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，记录吸光度。并分别对洗脱后的各组分取样，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达，可溶性及亲和层析效果。将收集的蛋白用Ultra-15(10kDa)超滤浓缩管离心浓缩到2mL，去掉不容颗粒并用分子排阻层析的方法进行纯化。

1.2.4 木糖标准曲线绘制[17]取9支试管按表1加入相关试液后再加入1.5mL DNS试剂，将试管中溶液摇至均匀，沸水浴反应5min，迅速冷却至室温，再使用蒸馏水将其定容至5.0 mL。取1号管为对照，在540 nm处测定其他各试管的OD值，结果见表1。

表1 不同木糖含量样本的配置与吸光度值Table 1 Configuration and absorbance values of different xylose content samples

1.2.5 XynB-E18酶活测定 酶活力定义：在37°C下每分钟分解底物释放1µmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。采用DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定木聚糖酶活力，取0.1 mL酶液于试管中，加入0.9mL 0.1%木聚糖底物，于50℃下水浴反应15 min后，加入1.5 mL DNS沸水浴中反应5 min，迅速冷却至室温显色。对照管在加入酶液和缓冲液后，先加DNS溶液再加底物溶液。将测得吸光值带入公式进行计算。

1.2.6 木聚糖酶XynB-E18的最适反应温度和热稳定性测定 在pH6.5、温度10～80℃范围内检测木聚糖酶XynB-E18对木聚糖的分解能力，确定酶的最适温度。将蛋白溶液分别置于上述不同温度中12 h后，在50℃，pH=6.5下检测残余相对酶活力，确定酶的热稳定性。

1.2.7 木聚糖酶XynB-E18的最适pH和pH稳定性测定 在50℃时，测定木聚糖酶XynB-E18在pH 3.0～12.0范围内反应的酶活，确定其最适pH值。将蛋白溶液分别置于上述pH中，在4℃下放置12 h后测定酶的残余活力，确定酶的pH稳定性。

2 结果与分析

2.1 同源性分析

与 XynB-E18最相似的三个蛋白分别来自Bacillus Haloduran的 2UWF、Paenibacillus barcinonensis的4W8L、以及来自G.stearothermophilus的2Q8X，相似度为41%、42%和66%。序列比对结果如图1。

图1 XynB-E18与其他三种来源的木聚糖酶序列的部分对比分析Fig.1 Partial comparative analysis of xylanase sequences from three other sources

在这四个蛋白中，均存在一个催化结构域，即由8个β折叠片和8个α螺旋环绕而成的“TIM-桶”结构，8个β折叠在桶的内侧：17-22（β1）、39-44（β2）、77-86（β3）、127-134（β4）、173-179（β5）、205-215（β6）、236-245（β7）、284-291（β8），8个α螺旋在桶的外侧：23-36（α1）、61-74（α2）、103-123（α3）、147-154（α4）、183-200（α5）、219-232（α6）、260-281（α7）、322-330（α8），这些结构相对保守。“TIM桶”结构的横截面是椭圆形，长轴横跨桶结构β折叠1号到5号结构域，在该截面的长轴端点处，“桶”的顶端较高，而在短轴的端点处较低，形成“碗型腔”，差异主要围绕在“碗”的较高边缘，特别是在β7到β8、β4到β3折叠之间的位点。在形成的“碗型腔”结构中，酶的活性位点位于该空腔的内部，其中心位于可接近的开放区域，对于不同的酶，无规则卷曲的不同构象可能与活性位点的裂缝和活性位点的拓扑结构有关，并可能反映了其特定的酶学特性[18-20]。因此若要探究木聚糖酶XynB-E18的酶活性质，对其活性中心的研究至关重要，尤其可从序列和结构方面进行分析，从而讨论该酶稳定性和催化作用的可能机制。

2.2 XynB-E18的原核表达情况

经重组质粒pET28b(+)-XynB-E18转化的感受态细胞，在大约38kD处出现一条明显的新增条带，与预测分子质量相符，蛋白诱导后的条带比诱导前明显清晰，说明在16℃180 r·min-1条件下蛋白获得了高效表达。在上清液条带蛋白含量高且纯度高，没有杂蛋白存在，说明目的蛋白可溶性较好。在50 mol·L-1咪唑缓冲液的条件下蛋白基本被洗脱，说明在低浓度的咪唑缓冲液下蛋白与Ni柱的亲和性不高，容易被洗脱。

图2 XynB-E18的Ni亲和层析SDS-PSAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE of XynB-E18 by Ni affinity chromatography

2.3 XynB-E18蛋白的分离纯化结果

使用AKTA蛋白纯化系统进行分子排阻层析。先用超纯水冲洗1倍体积之后，使用分子筛层析缓冲液（20mol·L-1Tris pH7.5 500mol·L-1NaCl）进行替换，继续冲洗1倍体积直到系统内的盐浓度稳定，方可进行浓缩蛋白的上样操作，使用收集器对目的蛋白的280 nm紫外峰进行收集，再次进行SDS-PAGE操作。

亲和层析纯化图谱显示，收集到的目的蛋白峰型较好，有较强的对称性，说明层析条件合适，效果明显。分子筛图谱的出峰时间符合分子量为38kD的目的蛋白出峰时间。经分子筛后的XynB-E18的SDS-PAGE电泳图谱中只有一条明显蛋白条带，无杂带，说明经分子筛层析后蛋白具有较高的纯度（如图3）。

图3 XynB-E18分子筛层析图Fig.3 XynB-E18 molecular sieve chromatogram

2.4 木聚糖酶XynB-E18活性测定

2.4.1 绘制标准曲线 以540nm处测得的OD值为纵坐标，木糖含量为横坐标绘制标准曲线（图4）。

图4 木糖的标准曲线Fig.4 Standard curve of xylose

2.4.2 木聚糖酶XynB-E18的酶活力 根据木聚糖酶标准曲线的结果，得出其酶活的计算公式为：酶活（U）=（OD540+0.1118）/0.5926×N/T（N：酶液稀释倍数；T：反应时间）。经条件筛选，浓度为0.1 mol·L-1的酶活力较好，将稀释了10000倍的蛋白溶液在50℃，pH=6.5下反应10 min，酶活力可达到1782 U。

2.4.3 木聚糖酶XynB-E18的最适pH和pH稳定性 在40℃时，测定XynB-E18在pH3.0～12.0的酶活，确定其最适pH值，结果如图所示(图5-A)。该酶在酸性pH下反应活性较弱，最适反应pH约为6.5。对其稳定性检测结果如图所示(图5-B)，在碱性条件下，酶可以保持较好的活性，活力损失相对较小，在pH 6-10，4℃下放置12 h，相对酶活性仍可保持在80%以上，但是在酸性条件下，酶活性发生了较大水平的波动，特别在pH4以下的条件处理后，相对酶活低于20%。

2.4.4 木聚糖酶XynB-E18的最适反应温度和热稳定性 在pH=6.5，温度为10～80℃下检测XynB-E18酶活力，结果如图所示(图5-C)，酶的最适反应温度在50℃左右，40～50℃之间其相对酶活均可保持在80%以上。对于热稳定性的研究，结果如图所示，该酶热稳定性较差，在10～30℃下放置12 h后，其相对酶活维持在80%以上，在40℃时放置12 h后，残余60%酶活力，而在50℃时放置12 h后，酶活力急剧下降，70℃时基本失活(图5-D)。

图5 XynB-E18的酶学特性Fig.5 Enzymatic properties of XynB-E18

3 讨论

本文采用体外重组法，在大肠杆菌中高效表达了Xyn-E18蛋白，实验方法相对成熟，稳定性较好。采用Ni亲和柱和分子筛对该蛋白质进行分离纯化，并对纯化后的蛋白进行浓缩，最终获得了高纯度的目的蛋白，其分子质量约为38 kDa，与粗酶液相比纯度提高了约20倍。对纯化后的XynB-E18进行酶学性质分析，结果表明，木聚糖酶XynB-E18的最适反应温度为50℃，在40～50℃时其相对酶活维持在80%以上。最适反应pH为6.5，接近中性，这符合细菌木聚糖酶适合在中性或碱性条件下作用这一现象[21]，与近几年已报道的木聚糖酶稳定性相比，Xyn-E18具有较宽的pH稳定范围，在pH6～10，4℃下放置12 h，相对酶活性仍可保持在80%以上。据报道，耐热子囊菌木聚糖酶活最适pH4.8，在pH3～7时稳定性能较好[22]。Horikoshi从碱性细菌Bacillussp.No.C-59-2中纯化的木聚糖酶的最适pH是6～8[23]。Taneja等筛选到一株嗜碱真菌Aspergillus nidulansKK-99，该菌产的木聚糖酶的最适为8.0[24]。

研究木聚糖酶Xyn-E18一级结构是探索该酶热稳定性、pH稳定性等的基础。一方面，酶的良好活性依赖蛋白的正确构象，另一方面，稳定良好的催化活性表明酶保持着天然蛋白构象，因此要解释木聚糖酶Xyn-E18的活性机制，需从三维结构分析。本文中成功表达的XynB-E18具有良好的酶学特性，保持着稳定的天然构象，为下一步对蛋白结构与功能的研究提供了有利依据，也为最终的晶体学研究和工业化应用奠定基础。

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