兰　萌，梁语燕，高晓峰，窦　妍,2，杨明琰,2，樊　成，段　洁

(1 长安大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710054；2 旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西 西安 710054；3 陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048)

微生物絮凝剂(MBF)是一类由微生物产生的具有絮凝活性的物质，主要化学成分是糖蛋白、多糖、蛋白质、糖醛酸、脂质、核酸等大分子物质，因其特定的结构和组成而形成了良好的絮凝沉淀性能[1-3]，已经用于染料废水[4]、无机固体悬浮液[5]及各种重金属废水[6]的处理研究。与传统化学絮凝剂无机盐(如硫酸铝、氯化铁等)及其聚合物(如聚合氯化铝、聚合硫酸铝或铁等)和有机合成的高分子化合物(如聚丙烯酰胺)相比，微生物絮凝剂具有安全、无毒、可生物降解、无二次污染的优点[7-8]。但一般微生物絮凝剂培养成本高，所产絮凝剂活性较低，使其推广应用受到一定限制。胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginous)是在农业生产上应用推广多年的微生物肥料生产菌株，具有溶磷、解钾、解硅、固氮的作用，也称硅酸盐细菌或钾细菌[9-10]。近年来很多研究发现胶质芽孢杆菌还是一类良好的微生物絮凝剂，经发酵培养可以产生大量的胞外多糖，特别是在无氮培养基上生长时，菌体外可以产生数倍于菌体体积的荚膜多糖。基于菌体吸附、胞外多聚物絮凝及代谢中产生的有机酸、氨基酸中和重金属离子的毒性等原理，胶质芽孢杆菌在颗粒中间起中和电荷、吸附、桥联、网捕等作用, 从而实现胶体脱稳、絮凝沉淀、固液分离、重金属吸附[11-12]。此外，胶质芽孢杆菌可以自生固氮，发酵培养不需要氮源，营养要求低，克服了微生物絮凝剂生产成本高的缺点。由于其在农业生产上应用多年，安全性高，是一种具有实际应用价值的优良生物絮凝剂生产菌种，因此在给水处理、城市生活污水处理、食品加工、发酵、化工、畜牧、建材等行业废水处理等方面都具有广泛的应用前景[13]。

本研究以从造纸厂活性污泥中分离得到的1株胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginous) MY6-2为对象，分析其絮凝剂化学成分、絮凝特性及对重金属Pb2+的吸附特性，旨在为微生物絮凝剂的实际应用提供参考和数据支撑。

1　材料与方法

1.1　材　料

菌株胶质芽孢杆菌MY6-2由长安大学生物工程实验室分离保藏。

可溶性淀粉购自西安延河化工厂，活性炭、硅藻土、膨润土由陕西省微生物研究所提供，分别用去离子水配成质量分数为0.3%的悬浮液。黄土取自长安大学校园，105 ℃下烘干、研磨，过0.147 mm筛，配制成0.3%(质量分数)的悬浮液。

聚丙烯酰胺(PAM)、聚合氯化铝(PAC)、聚合氯化铁(PFC)由陕西科技大学造纸工程学院提供。

1.2　胶质芽孢杆菌MY6-2絮凝剂的发酵培养

将胶质芽孢杆菌MY6-2接种至发酵培养基，37 ℃培养72 h制得絮凝剂MY6-2发酵液[13]。

1.3　胶质芽孢杆菌MY6-2絮凝剂的分离纯化

将胶质芽孢杆菌MY6-2发酵液于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取上清液，减压浓缩4～5倍，搅拌加入3倍体积的无水乙醇使其终体积分数为75%，4 ℃冰箱内放置24 h后，充分沉淀，4 000 r/min离心15 min，收集沉淀。重新溶于去离子水，用无水乙醇洗3遍，收集沉淀，溶于去离子水，透析处理24 h，冷冻干燥得MY6-2絮凝剂沉淀纯品。收集离心后的沉淀即为胶质芽孢杆菌菌体。

1.4　胶质芽孢杆菌MY6-2絮凝剂化学成分的测定

用考马斯亮蓝法测蛋白质含量[14]；用硫酸苯酚法测多糖含量[15]；将MY6-2絮凝剂于波长190～400 nm紫外扫描，根据其在260，280 nm波长的光吸收情况，初步确定絮凝剂的主要化学成分。

1.5　胶质芽孢杆菌MY6-2絮凝剂特性

1.5.1絮凝活性的影响因素(1)pH。在100 mL高岭土悬液中，加入2 mL MY6-2发酵液和2 mL 1%(质量分数，下同) CaCl2金属助凝剂，分别用1 mol/L HCl和NaOH调节高岭土悬液的pH为6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，研究不同pH对MY6-2絮凝剂活性的影响。试验重复3次。

(2)絮凝剂用量。在100 mL高岭土悬液中，分别加入0.5，1，2，4，6，8，10 mL MY6-2发酵液，使絮凝剂用量分别为5，10，20，40，60，80，100 mL/L，加入2 mL 1% CaCl2金属助凝剂，调节pH值至7.0～7.5，研究絮凝剂用量对MY6-2絮凝剂活性的影响。试验重复3次。

(3)金属阳离子助凝剂。在100 mL高岭土悬液中，加入2 mL MY6-2发酵液，分别用质量分数1%的Al2(SO4)3、ZnCl2、CuSO4、FeCl3、MgSO4和CaCl2溶液作金属阳离子助凝剂，以不加助凝剂为对照，调节pH至7.0～7.5，研究不同金属阳离子助凝剂对MY6-2絮凝剂活性的影响。试验重复3次。

(4)CaCl2用量。在100 mL高岭土悬液中，分别加入0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 mL 1%的CaCl2溶液，使CaCl2用量分别为0，10，20，30，40，50，60，70，80 mL/L，调节pH至7.0～7.5，研究CaCl2用量对MY6-2絮凝剂活性的影响。试验重复3次。

1.5.2MY6-2絮凝剂的耐热性将MY6-2絮凝剂在100 ℃水浴中分别加热0，5，10，15，20，25，30 min，测其絮凝活性，分析其耐热性。

1.5.3MY6-2絮凝剂的初步应用分别称取经过处理的活性炭、淀粉、硅藻土、膨润土及经过处理(烘干、研磨、过0.147 mm筛)的黄土0.3 g，置于250 mL的三角瓶中，加蒸馏水至100 mL，再分别加入2 mL MY6-2发酵液、聚丙烯酰胺(PAM)、聚合氯化铝(PAC)、聚合氯化铁(PFC)，然后加入2 mL 1% CaCl2金属助凝剂，调节pH至7.0～7.5，分别测其絮凝活性，比较MY6-2絮凝剂与3种传统絮凝剂对不同絮凝体系的絮凝效果。

1.6　不同因素对MY6-2絮凝剂吸附Pb2+活性的影响

1.6.1pH在100 mL质量浓度为200 mg/L的Pb(NO3)2溶液中加入8 mL MY6-2发酵液，分别调节溶液pH值至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，150 r/min摇床振荡30 min，静置3 h后，测定上清液中的Pb2+质量浓度，计算吸附活性。试验重复3次。

1.6.2Pb2+初始质量浓度向100 mL质量浓度分别为40，60，80，100，200，300，400，500，600，800 mg/L的Pb(NO3)2溶液中加入8 mL MY6-2发酵液，调节溶液pH值至4.0，150 r/min摇床振荡30 min，静置3 h，测定上清液中的Pb2+质量浓度，计算吸附活性。试验重复3次。

1.6.3絮凝剂用量分别取2，4，6，8，10，12 mL MY6-2发酵液，加入装有100 mL质量浓度为200 mg/L Pb(NO3)2溶液的三角瓶中，使MY6-2用量分别为20，40，60，80，100，120 mL/L，调节pH值至4.0，150 r/min振荡30 min，静置3 h，测定上清液中Pb2+的质量浓度，计算吸附活性。试验重复3次。

1.7　测定项目与方法

1.7.1絮凝活性[16]在100 mL质量分数为0.3%的高岭土溶液中，加入2 mL 1% CaCl2溶液和2 mL MY6-2发酵液，调节pH至7.0～7.5，150 r/min摇床振荡3 min后静置1 min，取其上清液，用752分光光度计测定上清液在波长550 nm时的OD值，同时以蒸馏水代替MY6-2发酵液作为空白对照。絮凝活性计算公式为：

絮凝活性=(A-B)/A×100%。

式中：A为对照上清液在波长550 nm处的OD值，B为样品上清液在波长550 nm处的OD值。

1.7.2吸附活性在100 mL不同质量浓度的Pb(NO3)2中加入8 mL MY6-2发酵液，调节pH至4.0，150 r/min摇床振荡30 min，静置3 h后，用火焰原子吸收法[17]测定上清液中的Pb2+质量浓度，同时以蒸馏水代替MY6-2发酵液作为空白对照。吸附活性计算公式为：

吸附活性=(C-D)/C×100%。

式中：C为对照溶液中的Pb2+质量浓度，D为样品上清液中的Pb2+质量浓度。

2　结果与分析

2.1　MY6-2絮凝剂的制备及化学成分分析

经过分离纯化，得到的胶质芽孢杆菌MY6-2沉淀纯品为浅黄色粉末。化学成分测定结果表明，MY6-2絮凝剂主要由多糖组成，占样品的65.68%。紫外扫描结果显示，絮凝剂MY6-2在260和280 nm处无特征吸收峰，进一步说明该絮凝剂的主要成分中不含核酸和蛋白质。分别取1.3节制备的MY6-2多糖样品及菌体测其絮凝活性，结果发现，多糖样品的絮凝活性为95%，菌体的絮凝活性为62%，表明上清液中的多糖主要起絮凝作用。本研究还发现，胶质芽孢杆菌菌体外有1个数倍于菌体体积的荚膜，其中产生的荚膜多糖有助于絮凝活性的提高，因此制备成品絮凝剂时不需要进行固液分离，用发酵液直接醇沉即可，这样既简化了生产工艺，又提高了絮凝活性。

2.2　MY6-2絮凝剂的絮凝特性

2.2.1絮凝活性的影响因素(1) pH。图1显示，当絮凝体系pH为6.0时，MY6-2无絮凝活性；当絮凝体系pH为6.0～7.0时，随pH升高，絮凝活性迅速增大；pH大于7.0时，絮凝活性随着pH的增大而基本保持在95%左右，即在碱性条件下，该絮凝剂具有较高的活性。

(2)絮凝剂用量。由图2可知，当絮凝剂用量在5～20 mL/L时，MY6-2絮凝剂活性随着絮凝剂用量的增加而增大，当用量达20 mL/L时，絮凝活性较高；超过20 mL/L后，絮凝活性随着絮凝剂用量的增加基本保持不变，可知絮凝剂用量以20 mL/L为宜。分析其原因在于，絮凝剂用量过高时，悬浮颗粒基本被絮凝沉淀，絮凝剂处于过剩状态，故絮凝活性保持不变。

图1　pH对MY6-2絮凝剂活性的影响Fig.1　Effect of pH on flocculating activity of flocculant MY6-2

(3)金属阳离子助凝剂。Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+对MY6-2絮凝剂的絮凝活性影响如图3所示。由图3可知，与对照相比，二价金属离子Ca2+、Cu2+、Mg2+对MY6-2絮凝剂都有较好的助凝效果，但由于Mg2+、Cu2+属重金属，可能会造成环境污染，而Ca2+助凝效果最好且不会造成环境污染，因此本研究选择Ca2+作为最佳助凝剂。

(4)CaCl2用量。不同CaCl2用量对MY6-2絮凝剂活性的影响见图4。由图4可知，当CaCl2用量在20 mL/L以内时，絮凝活性随CaCl2用量的增加而提高；当CaCl2用量大于20 mL/L时，随着CaCl2用量的增加，絮凝活性基本保持在97%以上。因此100 mL高岭土悬浮液中助凝剂CaCl2的用量以2 mL为宜。

图3　金属阳离子助凝剂对MY6-2絮凝剂活性的影响Fig.3　Effect of cation supplement on flocculating activity of flocculant MY6-2

2.2.2絮凝剂的热稳定性图5显示，在100 ℃水浴中加热30 min后，MY6-2絮凝剂的絮凝活性仍高达98.4%，表明该絮凝剂具有良好的热稳定性。这可能是因为MY6-2絮凝剂主要成分为多糖，而蛋白含量很少，故其热稳定性较好。

2.2.3絮凝剂的应用研究MY6-2絮凝剂在不同絮凝体系(包括活性炭、黄土、硅藻土、膨润土、淀粉悬浮液)的絮凝效果，并与传统絮凝剂PAM、PAC、PFC进行比较，结果如表1所示。 由表1可知，与其他传统的絮凝剂相比，MY6-2絮凝剂对膨润土、淀粉、活性炭、硅藻土、黄土体系均具有很好的絮凝活性，说明该微生物絮凝剂具有广泛的适用性。

图5　MY6-2絮凝剂的热稳定性Fig.5　Thermal stability of flocculant MY6-2

Table 1　Comparison of flocculating activities between MY6-2 and conventional flocculants %

注：“-”表示无絮凝活性。

Note：“-”indicates no flocculating activity.

2.3　不同因素对MY6-2絮凝剂吸附Pb2+的影响

2.3.1溶液pH溶液pH是影响吸附过程的关键参数之一。溶液pH对MY6-2絮凝剂吸附Pb2+的影响如图6所示。

图6　溶液pH对MY6-2絮凝剂吸附Pb2+的影响Fig.6　Effect of initial pH on Pb2+ adsorption by flocculant MY6-2

由图6可知，当溶液pH为2.0～4.0时，Pb2+吸附活性随着pH的增加而增大；pH在4.0～7.0时，吸附活性基本不变。研究发现，多糖絮凝剂含有各种酸性功能团，随着溶液pH的增加，其酸性功能团发生电离，使多糖带有大量的负离子，可以与金属阳离子发生静电相互作用，从而使金属离子的吸附活性提高；此外，随着多糖链电离度的增大，多糖长链分子由卷曲状态变为伸展状态，提高了长链的架桥能力，由于长链的架桥作用，使Pb2+迅速絮凝沉降[18]。本研究中，当溶液pH超过5.0以后，体系出现沉淀，因此，MY6-2絮凝剂在pH为4.0时具有最好的Pb2+吸附效果。

2.3.2Pb2+初始质量浓度Pb2+初始质量浓度对MY6-2絮凝剂吸附Pb2+的影响如图7所示。由图7可知，随Pb2+初始质量浓度的增加，吸附活性呈现先升后降的趋势。当Pb2+初始质量浓度为100～500 mg/L时，絮凝活性较高，保持在80%以上；当Pb2+初始质量浓度小于100或大于500 mg/L时，吸附活性下降。这是因为当溶液中Pb2+质量浓度较低时，MY6-2絮凝剂表面的吸附位点不能与Pb2+充分接触，故吸附活性不高；而当Pb2+质量浓度过高时，由于絮凝剂吸附位点达到吸附饱和，不能再对更多的Pb2+离子产生吸附作用。

2.3.3絮凝剂用量MY6-2絮凝剂用量对其吸附Pb2+的影响如图8所示。图8显示，随着MY6-2絮凝剂用量的增加，吸附活性逐渐增大，当絮凝剂用量为80 mL/L时，吸附活性达到最高，之后随絮凝剂用量的增加，吸附活性降低。故絮凝剂最佳用量为80 mL/L。

图7　Pb2+初始质量浓度对MY6-2絮凝剂吸附Pb2+的影响Fig.7　Effect of initial concentration on Pb2+ adsorption by flocculant MY6-2

3　讨　论

目前，国内外对微生物絮凝剂的研究主要集中在高效微生物絮凝剂的筛选、培养条件的优化、复合菌剂以及微生物与传统絮凝剂复配使用等方面[13]，着眼于降低微生物的培养成本，提高絮凝效率。Liu等[19]筛选得到的微生物ChryseobacteriumdaeguenseW6可以在低氮培养基上生长，使细菌的培养成本降低50%～80%。Yang等[20]将微生物絮凝剂MBFGA1和PAC复配使用，不仅降低了PAC的使用剂量，提高了微生物絮凝剂的使用效率，而且减少了PAC对环境的二次污染。Zhang等[21]发现，Staphylococcussp.BAFRT4和Pseudomonassp.CYGS1联合使用的絮凝效果优于二者单独使用。但是大多数报道的微生物培养都需要氮源，导致絮凝剂的培养成本提高。 Lian等[22]报道称，菌株BacillusmucilaginosusGY03在培养过程不需要氮源，但其主要絮凝成分分布在发酵液的上清液中，絮凝剂得率不高，而且增加了分离絮凝剂的成本。本研究中，胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginous)MY6-2在无氮培养基上生长可以产生数倍于菌体体积的荚膜，且发酵液及荚膜的主要成分都是多糖，均具有絮凝活性，不需分离菌体和发酵液就可直接使用，既可以使微生物的絮凝活性提高，也可以简化生产工艺，使生产成本大大降低。此外胶质芽孢杆菌是在农业生产上应用推广多年的微生物肥料生产菌株，使用安全性高，故其是具有推广应用价值的微生物絮凝剂。

本研究还探索了胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginous)MY6-2在吸附重金属方面的应用。利用微生物产生的胞外多糖对重金属进行吸附，因为微生物可生物降解，无二次污染，且吸附效率高，因此在众多的重金属离子处理方法中，微生物法受到越来越多的重视，是一项非常有前景的去除废水重金属的处理方法[23]。本研究分离的高絮凝活性胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginous)MY6-2絮凝剂对重金属Pb2+的吸附活性可达80%以上。

多糖类絮凝剂对重金属的吸附原理主要有离子交换、表面络合、无机微沉淀、氧化还原、静电吸附等，吸附机理十分复杂。随着研究的深入，发现在实际吸附过程中可能同时存在多种吸附机理。无论何种吸附机理，溶液pH、金属离子的初始质量浓度对多糖类絮凝剂和重金属离子的性质以及二者的相互作用都有重要的影响，从而影响多糖类絮凝剂对重金属离子的吸附活性[6]。本研究分析了溶液pH、Pb2+初始质量浓度、MY6-2絮凝剂用量等因素对絮凝剂吸附Pb2+的影响，但对多糖类絮凝剂的化学组成及其对重金属的吸附机理，以及复合金属污染和其他有机物存在时絮凝剂的吸附特性等问题仍需进一步研究。

4　结　论

1)通过发酵、醇沉、透析、冷冻干燥，得到胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginous)MY6-2生物絮凝剂，其主要化学成分为多糖，占样品的65.68%。

2)MY6-2絮凝剂具有良好的热稳定性，并且对膨润土、淀粉、活性炭、硅藻土等絮凝体系均具有很好的絮凝活性，说明该微生物絮凝剂具有广泛的适用性和较好的应用前景。

3)MY6-2絮凝剂最佳絮凝条件：pH>7.0,絮凝剂用量20 mL/L；助凝剂为质量分数1% CaCl2，用量为20 mL/L；在此条件下MY6-2絮凝活性可达到95%以上。

4)Pb2+吸附条件研究结果表明，溶液pH 4.0、Pb2+初始质量浓度为100～500 mg/L、絮凝剂用量为80 mL/L时，MY6-2絮凝剂对Pb2+的吸附活性均在80%以上。

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