周金雨，韩　隽，彭　超

（中粮生化能源（龙江）有限公司,黑龙江齐齐哈尔 161100）

玉米是世界上分布最广的作物之一，中国是世界第二大玉米生产国和消费国。玉米深加工过程中大约会产生30%的玉米蛋白粉、玉米皮、玉米胚芽粕及DDGS等副产物，大多数生产企业将副产物烘干后作为饲料原料出售，产品附加值低、消耗大量能源的同时也会造成环境污染。另外，许多饲料厂、饲养场（户）无科学依据地利用这些副产物，造成原料滥用、浪费、效率低的现象十分严重。目前，我国饲粮约占粮食总产量的35%，预计到2020和2030年，比重将分别达到45%和50%，但粮食预期年增量约有1%，饲粮缺口较大，其中优质蛋白质饲料资源将更加紧张，因此，尝试利用新型饲料原料代替日渐紧缺的常规饲料原料会成为未来饲料发展的必然趋势。

我国微生物发酵制品开始于20世纪20年代初，但到80年代后才有较快进展，其大部分是利用工农业生产中多种可再生资源生产饲料酵母和食用酵母，比如利用味精厂废液、淀粉厂废液等为原料，优化筛选出可在这些废液中良好生长的菌种，结合现代微生物发酵工程技术，高密度生产出产品。2001年Winsen提出了液体生物发酵饲料的指标，并被广大学者所认同，即pH＜4.5、LAB＞9 lg CFU/mL、乙酸含量＜40 mmol/L、乳酸含量＞150 mmol/L、乙醇含量＜0.8 mmol/L。液体生物发酵饲料的使用已有一段时间，但国外对其研究得较为深入（Winsen等，2001）。蔡兴旺等（2003）将生物法与氨化法和青贮法处理秸秆进行比较，结果表明，在同等饲喂条件下，生物发酵饲料的效果优于青贮饲料，而青贮饲料优于氨化饲料（蔡兴旺等，2003）。Omafuvbe等（2004）发现，生物饲料在发酵过程可形成大量乳酸，使饲料有酸香的味道，刺激猪的食欲，进而提高采食量。王连生等（2009）研究发现，乳杆菌饲料可有效降低仔猪大肠杆菌的数量，降低腹泻率。林标声等（2010）研究发现，与不食用生物饲料的仔猪相比，食用生物饲料的仔猪平均日体重增长5.61%，饲料成本减少3.53%。

由以上研究可以发现，通过微生物作用生产生物饲料，使玉米深加工副产物得到合理利用，不仅可以提高企业的经济效益，而且可以减少环境污染，保障食品安全。

1　材料与方法

1.1材料与仪器菌种：地衣芽孢杆菌BL13、地衣芽孢杆菌BL20、地衣芽孢杆菌BL53、地衣芽孢杆菌BL47、地衣芽孢杆菌BL49、戊糖片球菌（10）-1由中粮健康营养研究院提供；枯草芽孢杆菌AN 由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供；枯草芽孢杆菌GY 由青岛根源生物技术集团有限公司提供；标准枯草芽孢杆菌10089、标准枯草芽孢杆菌10090 由国家微生物菌种保藏中心提供；酿酒酵母由安琪股份有限公司提供。

材料：谷氨酸渣、废液蛋白、糖渣、玉米浆、喷浆玉米皮、喷浆胚芽粕、糖蜜由公司自行提供。

仪器：高效液相色谱仪1260 infinity 安捷伦科技有限公司；电热恒温培养箱DHP-9272 上海安竞实验设备有限公司；生物传感分析仪SBA-40E 山东省科学院生物研究所；自动纤维分析仪A20001 上海龙捷仪器设备有限公司。

1.2试验方法

1.2.1菌种的活化与培养将一定量酿酒酵母菌粉于YPD液体培养基中，28 ℃发酵24 h，活化传代2次，在YPD固体培养基上划线，30 ℃培养48 h，挑取单菌落，继续活化。

将一定量枯草芽孢杆菌GY菌粉和枯草芽孢杆菌AN菌粉分别置于LB液体培养基中，30 ℃发酵24 h，活化传代2次，在LB固体培养基上划线，30 ℃培养48 h，挑取单菌落，继续活化。

戊糖片球菌（10）-1于-80 ℃冰箱中冷冻保存，取出并以2%接种量接种于MRS液体培养基中，于37 ℃过夜培养，活化传代2次。在MRS固体培养基上划线，置于37 ℃恒温培养箱培养48 h，挑取单菌落，继续活化。

除酿酒酵母、枯草芽孢杆菌GY和枯草芽孢杆菌AN之外，其余菌种于-80 ℃冰箱取出，接种于相应的液体培养基中，在适宜温度下培养一段时间，活化传代2次，在相应固体培养基上划线，适宜温度下培养48 h，挑取单菌落，继续活化。

1.2.2发酵培养基综合动物对饲料营养的需求、原料产量、原料成本、成品水分含量及乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌生长条件，并结合公司对附近市场的调研结果等各方面的考虑，设计如下配方。

表1　生物饲料的配方组成 %

表2　试验设计表

1.2.3接种量发酵饲料的总接种量为2%，具体3种菌的接种比例如表3，为了消除菌浓度不同对发酵产生的影响，在接种前，将所有菌浓度调为一致。按表3接种后，28 ℃恒温发酵4～6 d。

表3　配方中各菌的接种量

1.2.4菌落总数的测定酵母菌采用平板菌落计数法（周传云，2006），乳酸菌和芽孢杆菌采用倾注平板法菌落计数。

1.2.5理化指标的测定

乙醇、总糖、总酸：样品经前处理后，采用高效液相色谱仪测定上述指标。

水分：采用国标方法GBT6435-2006测定样品中的水分含量。

灰分：采用国标方法GBT6438-2007测定样品中的灰分含量。

酸度：采用国标方法GBT12456-2008测定样品的酸度。

葡萄糖和乳酸：取1 g样品于离心管中，加入9 g蒸馏水，混匀，从离心管中取出1 mL稀释液，再加入9 mL蒸馏水，混匀。取两次稀释后的稀释液，过0.22 μm滤膜，取一定量的滤液，用生物传感分析器测定样品中的葡萄糖和乳酸含量。

粗蛋白质：称取0.5 g（精确度为0.0001g）样品置于消化管中，加入6.00 g硫酸钾和硫酸铜的混合物（K2SO4：CuSO4=97：3），再加入15 mL浓硫酸，240 ℃消化1.5 h。将消化液转移至500 mL容量瓶定容，加碱至颜色变为深蓝色，400 ℃蒸馏，吸收液为2%硼酸溶液。蒸馏后，用0.05 mol/L硫酸滴定。

纤维：取1 g（精确度为0.0001g）样品于三角瓶中，加入150 mL 0.13mol/L硫酸，使其沸腾30 min，用抽滤设备将其中液体除去，并用热水反复洗涤5次，而后加入150 mL 0.23 mol/L氢氧化钾溶液沸腾30 min，冷却一段时间，用绿滤纸过滤，用丙酮洗涤3次，而后130 ℃干燥2 h，放入干燥器中冷却20 min，继续碳化20 min，500 ℃马弗炉灰化至恒重。

1.3数据处理每个试验重复2次，运用Microsoft excel 2003和SPSS Statistics软件进行数据分析。

2　结果

对照组未检出3种微生物，故图1未显示，由图1看出，乳酸菌含量较多的枯草芽孢杆菌GY3、地衣芽孢杆菌BL13和地芽孢杆菌BL20，酵母菌含量较多的是地衣芽孢杆菌BL47和地衣芽孢杆菌BL49，芽孢杆菌含量较多的是地衣芽孢杆菌BL20和地衣芽孢杆菌BL47。

图1　生物饲料中3种微生物的菌落数

由图2看出，试验组的水分变化幅度不大，大多在43%左右；地衣芽孢杆菌BL47实验组蛋白质增长幅度较小外，其他实验组粗蛋白质含量均有一定幅度的提高。

图2　生物饲料中水分和粗蛋白质的含量

由图3看出，试验组的乙醇含量远高于对照组（P＜0.05），除了地衣芽孢杆菌BL20和地衣芽孢杆菌BL47试验组相对较少外，证明实验组中酵母菌生长旺盛；试验组的总糖含量远低于对照组（P＜0.05），证明在该基质中微生物大量生长；总酸方面，除了地衣芽孢杆菌BL47实验组相对较少外，大部分试验组与对照组相差并不显著（P ＞ 0.05）。

图3　生物饲料中乙醇、总糖和总酸含量

由图4看出，灰分方面，试验组与对照组差异不显著（P＞0.05）；酸度方面，除地衣芽孢杆菌BL47相对较低外，其他组与对照组相比均不显著（P＞0.05）；葡萄糖方面，试验组低于对照组（P＜0.05），同样反映出在生物饲料中有微生物大量生长。乳酸方面，与酸度呈现相似的规律。

图4　生物饲料中灰分、酸度、葡萄糖和乳酸含量

由图5看出，试验组粗纤维含量相比对照组也得到不同程度的下降，其中枯草芽孢杆菌AN、地衣芽孢杆菌BL49、地衣芽孢杆菌BL53和标准10090+10089试验验组粗纤维含量下降较显著（P＜ 0.05）。

图5　生物饲料中粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量

3　讨论

在芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌计数过程中发现如下问题：

酵母菌采用倾注法菌落计数，并未发现平板有菌落，但采用涂布平板法菌落计数，有菌落生长，分析可能原因是酵母菌生长所需温度在28 ℃左右，而采用倾注法时，为了不使培养基凝固，需在40 ℃左右倾注平板，故酵母菌可能因为培养基温度过高而失活。

芽孢采用倾注平板法计数，但需在凝固的培养基上倒一层薄薄的2%琼脂，以防芽孢生长过于旺盛，影响计数。

MRS培养基中加入500 mg/kg那他霉素，YPD培养基中加入10 mg/kg青霉素和50 mg/kg链霉素抑制芽孢生长。

4　结论

综合菌落数、发酵度、乳酸、蛋白质、纤维含量等的结果选择糖渣23%、喷浆玉米皮11%、胚芽粕42%、谷氨酸渣2%、糖蜜2%、水20%作为培养基，接种0.6%戊糖片球菌（10）-1、0.4%酿酒酵母，1.0%枯草芽孢杆菌GY或地衣芽孢杆菌BL 49或地衣芽孢杆菌BL 53，28 ℃恒温发酵4～6 d。得出一种高乳酸、高蛋白、低纤维生物饲料，其中含有2.0%乳酸、20.7%粗蛋白质、4.3%粗纤维、3.1%灰分、6.6 lg CFU/mL乳酸菌、7.5 lg CFU/mL酵母菌、7.0 lg CFU/mL芽孢杆菌。

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