罗　兰，陈红莉，唐　辉*，张心跃，唐　萍

（1.新疆植物药资源利用教育部重点实验室，石河子大学药学院,新疆石河子 832002；2.新疆西部牧业股份有限公司,新疆石河子 832099）

棉油皂脚是在棉籽精炼过程中碱炼中和产物，皂脚的产出率约为棉油总产量的5%～10%。皂脚中的主要成分为脂肪酸盐、磷脂、中性油、棉酚、水分及其他类脂物（赵红涛等，2013）。棉油皂脚中脂肪酸可以根据需要进行加工制备，应用于相关行业（王颖颖，2011），进一步延伸棉油加工产业链。由于从棉油皂脚中提取的酸化油成分复杂，所含棉酚对动物有生殖毒性（吕云峰，2010），采用一般的方法既不能将棉酚等有色杂质有效脱除，也不能将脂肪酸有效分离。分子蒸馏法主要是一种针对易分解，沸点较高或者热敏物质的分离方法（吴琼，2015；胡伟，2011；Batistella C B，2002；马传国，2001），不仅能脱除酸化油中的色素（包括棉酚）和鞣质，同时能增加脂肪酸的饲用安全性。本文采用分子蒸馏法分离酸化油中的脂肪酸，得到皂脚脂肪酸精组分，可应用于饲料化研究。根据本课题组前期研究结果已知，棉油皂脚中主要含有硬脂酸、棕榈酸和亚油酸3种脂肪（罗兰，2017），因此，将脂肪酸甲酯衍生化进行GC检测（刘丹，2011），以3种脂肪酸含量作为分离效果及目标产物（皂脚精组分）的评价指标。本文在制备酸化油基础上，用分子蒸馏法分离酸化油中脂肪酸，建立脂肪酸、棉酚含量测定方法，并对其含量进行检测，为后续皂脚饲料产业化奠定基础。

1　仪器与试剂

VKL 70-5-WRS-T型分子蒸馏仪，Agilent 6890气相色谱仪，Waters 2695高效液相色谱仪，ES 225 SM-DR分析天平（瑞士），TDL-40 B型离心机（上海安亭飞鸽）。

棉油皂脚（新疆石河子汇昌油脂厂，20161116）、亚油酸甲酯对照品、棕榈酸甲酯对照品、硬脂酸甲酯对照品（纯度≥ 98%，上海源叶生物科技有限公司）、苯丙酮和正己烷。

2　实验方法与结果

2.1确定考察指标棉油皂脚中主要含有亚油酸、棕榈酸、硬脂酸3种脂肪酸，将这3种脂肪酸的纯度及得率综合评分作为考察指标。

2.2溶液的制备

2.2.1内标溶液的制备精密移取苯丙酮10 μL于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，配制成浓度为1.009 mg/mL的内标溶液。

2.2.2对照品溶液的制备精密称量对照品棕榈酸甲酯25 mg，硬脂酸甲酯17.39 mg，亚油酸甲酯38 mg于1 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成棕榈酸甲酯，硬脂酸甲酯，亚油酸甲酯浓度分别为25.00、17.39、38.00 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取0.2000 g样品于10 mL带塞试管中，加入浓硫酸-甲醇（1：20）溶液2 mL，在60～70 ℃水浴中振荡15 min，冷却至室温，加入蒸馏水3～4 mL，混合均匀后加入正己烷萃取，静置分层，用无水硫酸钠脱水后转移正己烷层于10 mL容量瓶，精密加入1 mL内标溶液，即可进行GC分析。

2.3色谱条件与系统适用性实验色谱柱：Agilent 6890N 19091J-413 HP 5%phenyl Methyl Siloxane（30.0 mm×320 μm×0.25 μm）。柱温 ：恒温210 ℃（保持20 min）；进样口温度：270 ℃；FID 检测器温度：290 ℃；流速：0.8 mL/min；分流比：5：1；载气：N2；进样量：2 μL。在上述色谱条件下，进样分析。

图1　混和对照品

图2　经分子蒸馏法优化分离的脂肪酸精组分

2.4线性关系考察将混合对照品溶液稀释0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍制成一系列浓度梯度混合对照品溶液。按照上述色谱条件进行GC分析。并以对照品溶液质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），对照品与内标峰面积的比值为纵坐标（Y），分别绘制3种脂肪酸甲酯的标准曲线，线性回归方程如下（表1）。

表1　线性回归方程

2.5方法学考察

2.5.1精密度精密吸取对照品溶液1 mL，连续进样6次，测定峰面积，计算各脂肪酸甲酯的峰面积与内标物峰面积的比值，其RSD值分别为2.4%、2.6%、2.1%，表示仪器精密度良好。

2.5.2重复性取供试品6份，每份约0.2 g，精密称量，按“2.2”项下供试品溶液制备方法操作，计算棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸甲酯含量的RSD值分别为2.1%、2.0%、2.3%，表示该方法重复性良好。

2.5.3稳定性取供试品6份，每份约0.2 g，精密称量，在室温下放置 2、4、6、8、10、12 h 后测定，计算棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸甲酯含量的RSD值分别为2.0%、2.3%、2.1%，表明样品在12 h内稳定性良好。

2.5.4加样回收率精密称量9份样品，分别加入80%、100%、120%3种不同浓度的对照品，按“2.2”项下供试品溶液制备方法操作进行测定，计算平均回收率，棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸甲酯RSD值分别为2.6%、2.5%、2.2%。

2.6酸化油的制备将皂脚加水分散，加入1/10浓硫酸调节 pH 至 2～ 3，水浴（85 ℃）1.5 h，用热水洗至中性，分液离心得到上、中、下3层，分别是酸化油、鞣质、水。具体工艺如图3所示。

图3　酸化油制备工艺流程

2.7分子蒸馏单因素考察与结果

2.7.1蒸馏温度对分离效果的影响称取50 g酸化油加入到分子蒸馏仪中，设置压力为30 Pa，刮膜转速为340 r/min，反应温度分别为100、125、150、160、175、180、190 ℃。以液氮为深冷剂，当反应条件达到设定要求时开始进料，调节进料速率，待反应稳定后，收集精组分进行GC含量检测。2.7.2压力对分离效果的影响称取50 g酸化油加入到分子蒸馏仪中，压力分别设置为10、30、50、70、90 Pa，进料温度为 180 ℃，刮膜转速为340 r/min。以液氮为深冷剂，当反应条件达到设定要求时开始进料，调节进料速率，待反应稳定后，收集精组分进行GC含量检测。

2.7.3刮膜转速对分离效果的影响称取50 g酸化油加入到分子蒸馏仪中，刮膜转速分别设定为 260、280、300、320、340 r/min，进料温度为 180℃，压力为30 Pa。以液氮为深冷剂，当反应条件达到设定要求时开始进料，调节进料速率，待反应稳定后，收集精组分进行GC含量检测。

2.7.4单因素实验结果由图4可知，在一定范围内，随着操作压力的提高，精组分中脂肪酸纯度先升高后降低，收率呈下降趋势，这是因为当操作压力太小时，分馏出的精组分中杂质较多，脂肪酸比例降低，由于压力与温度的关系，当操作压力变大时，蒸馏温度也相应提高，未达到脂肪酸蒸馏要求，导致纯度与得率均有所下降；随着蒸馏温度的提高，纯度和得率均有所增加，但当温度升高到190 ℃，脂肪酸纯度降低，原因可能是蒸馏温度过高杂质也被蒸馏出；脂肪酸纯度与得率随转速的增加而增加，刮膜器转速太慢，加热壁面上不易形成均匀的液膜，转子转速太快会导致部分原料被甩到冷凝器上，所以会降低分离效率。

图4　压力、蒸发温度、刮膜转速对脂肪酸纯度和得率影响

2.8分子蒸馏法的正交实验优化与结果取50 g的酸化油3份，每份平行取3个样，根据单因素实验结果设定选取正交实验考察因素：蒸馏温度170、180、190 ℃，压力 30、 50、70 Pa，刮膜速率260、300、340 r/min，见表 3。

表3　正交因素水平

根据相关参考文献以及实验经验，对纯度、得率两个指标综合评分。分别取两个权重系数为ω1=0.6和ω2=0.4。综合评分=ω1* 纯度指标 +ω2* 得率指标。纯度指标为所检测的3种脂肪酸总重量与分子蒸馏出的精组分的比值。得率指标为精组分重量与酸化油重量的比值。

由表4可得：根据极差可知，影响因素的顺序为A＞B＞C，在正交实验中对实验结果影响最大的是A蒸发压力，其次是B蒸发温度，影响最小的C刮膜转速。因此，本实验理论最佳实验条件为A3B2C1。

由表5可知，A、B两个因子对实验结果均呈显著影响，即实验所选的蒸发压力、蒸发温度对实验结果产生显著影响，其中蒸发压力对实验结果的影响最大。而C因子对实验结果无显著影响。本实验选择的最佳条件应：A3B2C1，即蒸发压力：30 Pa，蒸发温度 ：180 ℃，刮膜速率 ：340 r/min。

2.9最佳实验条件的验证在最佳分子蒸馏条件下，纯度与得率综合评分达75.22，验证实验表明，该优化工艺可取，故确定该条件为最佳工艺。

2.10皂脚脂肪酸精组分的检测

2.10.1脂肪酸含量测定由表6可知，精组分纯度平均值83.1%，得率平均值63.4%，综合评分75.22。2.10.2游离棉酚测定通过HPLC法对棉酚进行分析检测，如图5所示。

表4　L9（34）正交试验结果

表5　方差分析

表6　皂脚精组分脂肪酸含量

图5　HPLC法测定游离棉酚

（1）对照品溶液的制备：精密称取棉酚对照品12.50 mg，置25 mL量瓶中，用乙腈定容，再精密吸取5～25 mL量瓶中，乙腈定容，摇匀即得。

（2）供试品溶液的制备：精密称取精组分10 g置锥形瓶中，以50 mL丙酮（HcL调节pH=2）溶解，45 ℃搅拌1 h后移至离心管中（3000 r/min，15 min）离心，将上清液转移至50 mL量瓶，丙酮定容，移取2～10 mL量瓶，乙腈稀释至刻度，再移取1～10 mL量瓶，乙腈定容，摇匀即得。

（3）色谱条件：色谱柱Waters TccQ·Tag Amino Acid Analysis C 18 Column（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流动相：乙腈：0.7%磷酸水=80：20；检测波长：238 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量 ：10 μL。

由图5可知：皂脚精组分中未检测出棉酚，经分子蒸馏可脱出酸化油中的棉酚，确保安全。

3　结论

酸化油中含有丰富的脂肪酸，采用分子蒸馏技术实现脂肪酸与杂质有效分离。选取操作压力、蒸发温度和刮膜速率3个主要影响因素作为考察对象，进行单因素考察及正交设计实验，确定反应条件为蒸发压力：30 Pa，蒸发温度：180 ℃，刮膜速率：340 r/min时分离效果最优，脂肪酸纯度达83.1%，得率达63.4%。通过本实验实现了棉油皂脚中脂肪酸的优化分离，提高了脂肪酸的纯度，增强安全性，扩大了应用范围，为后续棉油皂脚饲料化的研究提供依据。

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