冯路瑶，程显好**，董洪新，李维焕，陆贺港，李 寅，刘 静

（1.鲁东大学农学院，山东 烟台 264025；2.烟台市中医院肿瘤科，山东 烟台 264000）

牛樟芝（Antrodia camphorata） 又名牛樟菇、樟窟内菇、红樟芝，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲 （Hymenomycetes） 多孔菌科 （Polyporaceae） 薄孔菌属（Antrodia），是原产于台湾的珍稀药用真菌[1]。牛樟芝含有丰富的生物活性物质，三萜类物质为牛樟芝的主要活性成分之一[2]，具有多种生物活性，如保肝、调节免疫、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、降血压等[3]，近年来已逐渐成为国内外研究和开发的热点[4]。

研究表明，牛樟芝液体发酵培养可以在较短时间内获得大量的菌丝体和发酵液，能极大地提高产量，以弥补牛樟芝生长缓慢的缺点，但是其活性产物的含量较低[5]。

中药发酵技术研究发现，真菌在代谢过程中有可能对中药中的萜类、黄酮类、皂苷类等某些活性物质进行生物转化，消除中药的副作用，甚至形成新的成分或是生物活性更高的物质[6-8]，从而增强发酵产物的生物活性和药理作用。食（药）用菌发酵过程中，中药也可能会对发酵产物的生物活性和药理功能产生影响[9]。

赵艳[10]等将板蓝根、银杏叶、金银花、枸杞、连翘五味中药的水提物和醇提物加入灵芝的发酵培养基中，进行液体发酵培养，结果发现连翘水提物和枸杞醇提物均能促进灵芝胞内三萜的形成。中药中的某些成分能促进药用真菌的生长或活性产物的产生[11]。

虽然，关于提高牛樟芝液体发酵产三萜类物质含量的方法有不少报道，但大多是改变提取方法和提取时间。通过添加中药提取物来提高牛樟芝液体发酵产物中三萜类物质的含量，目前尚未见报道。本试验通过向牛樟芝液体发酵基础培养基中加入不同种类、不同浓度的水提物和醇提物，研究中药提取物对牛樟芝液体发酵生物量和三萜类物质含量的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1菌种

牛樟芝菌种，由鲁东大学农学院保存于PDA培养基上。

1.1.2培养基

菌种活化培养基：胡萝卜200 g L-1（煮汁）、葡萄糖20 g L-1、琼脂15 g L-1，pH自然。

液体种子培养基：麦芽50 g L-1（煮汁），pH自然。

发酵基础培养基：麦芽50 g L-1（煮汁），pH自然。

1.1.3中药材

枸杞（Lycium chinenseMill.）、陈皮（Pericarpiumcitri Reticulatae）、薏苡仁（Coix lachrymal-jobi）、连翘[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]、当归 （Radix angelicaSinensis）、蒲公英 （Herba taraxaci）均购自于烟台中医药世家药品超市。

1.1.4试剂

95%乙醇、齐墩果酸、高氯酸、冰醋酸、甲醇、香草醛，其中试剂类为国产分析纯或化学纯。

1.2　方法

1.2.1接种培养

（1） 菌种活化

采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化。将低温保藏菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，28℃，暗培养15 d。

（2） 液体种子制备

配制液体菌种培养基，在121℃条件下灭菌30 min，取出培养基，自然冷却至室温；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的菌种，封口。置于旋转式摇床上，在转速120 r·min-1、温度28℃条件下培养10 d，即为牛樟芝液体种子。

1.2.2中药水提物制备

将烘干后的中药研磨成粉末，加10倍水浸泡0.5 h，用电磁炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸30min，过滤，收集提取液，重复提取1次，进行抽滤，滤液合并后蒸发浓缩，备用。

1.2.3中药醇提物制备

烘干后的中药研磨成粉末，称取梯度浓度的量加入烧杯中，然后加入100 mL95%的乙醇溶液，用封口膜封住杯口，浸提48 h，期间适当的进行震荡。浸提完毕后，进行抽滤，得到的滤液再进行蒸发浓缩，备用。

1.2.4液体发酵

在500mL锥形瓶中，分别加入牛樟芝液体发酵基础培养基150 mL，分别添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%的枸杞、薏苡仁、陈皮、连翘、当归、蒲公英的水提物、醇提物。用封口膜封好，放入灭菌锅中，121℃灭菌30min。冷却后，接入牛樟芝液体菌种，接种量为1 mL摇床中，温度28℃，转速120 r·min-1，暗培养20 d。每个样品设3个重复，对照不加中药。

1.2.5生物量测定

用2层200目的尼龙网过滤发酵液，获得菌丝体，菌丝体用蒸馏水冲洗2次，然后置于烘箱中60℃干燥至恒重，测定牛樟芝菌丝的干重。

1.2.6总三萜含量测定

取不同中药培养基中生长的过滤烘干后的牛樟芝菌丝体，研磨成粉末，测定总三萜的含量。

样品溶液：取菌丝体粉沫状样品0.5 g于50mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，超声波（40 kHz） 提取2 h[12]，提取过程中需要经常摇动，3200 r·min-1离心10min，取上清液备用。

标准溶液：精确称取齐墩果酸10 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，配置成浓度为0.2 mg·mL-1的标准溶液。

标准曲线的制作：准确量取浓度为0.2 mg·mL-1的齐墩果酸标准溶液0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL，分别放入具塞磨口试管中，然后沸水浴加热挥发去溶剂。在每个试管中加入0.10mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，加塞。于60℃水浴恒温加热20 min，取出后立即用冰水冷却，再分别加冰醋酸5mL，摇匀，在550 nm处分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，齐墩果酸质量为横坐标作图，得到标准曲线[13]。

样品溶液的测定：取样品溶液各0.3 mL，置于3个磨口试管中，沸水蒸干溶剂，按照制作标准曲线的方法测定吸光度值，计算不同培养基不同时期牛樟芝菌丝中总三萜含量。

2　结果与分析

2.1　不同浓度中药水提物对生物量的影响

中药水提物的添加对牛樟芝菌丝体的生长会有促进作用，添加量过大或过小都会产生抑制作用。不同浓度中药水提物对菌丝体生物量的影响见图1。

图1　不同浓度中药水提物对牛樟芝生物量的影响Fig.1　Effects ofwater extracts of different Chinese herbmedicine on production of biomass

图1中（a）结果表明，枸杞水提物和陈皮水提物的添加对牛樟芝菌丝体的生长均有促进作用，在枸杞水提物浓度为1.5%时，菌丝体生物量有所下降，在陈皮水提物浓度为2.1%时，菌丝体生物量有所下降，但对菌丝体生长仍然有促进作用。薏苡仁水提物的添加，在低浓度和较高浓度时对牛樟芝菌丝体的生长产生抑制作用，其余均为促进作用。

图1中（b）结果表明，连翘、当归和蒲公英的水提物对牛樟芝菌丝体生长均有促进作用，随着浓度增大菌丝体生物量呈上升趋势，但是在高浓度时菌丝体生物量有降低趋势。

陈皮、蒲公英、当归水提物对牛樟芝菌丝体的促进作用较明显。薏苡仁水提物在浓度为2.1%时，对牛樟芝菌丝体的促进作用最明显。

2.2　不同浓度中药醇提物对菌丝体生物量的影响

不同浓度中药醇提物对牛樟芝菌丝体生物量的影响见图2。

图2结果表明，连翘醇提物不同浓度梯度对牛樟芝菌丝体的生长均有促进作用。蒲公英醇提物对牛樟芝菌丝体生长的促进作用较连翘小，高浓度时促进作用减弱。枸杞醇提物浓度在1.5%时，对牛樟芝菌丝体的生长有明显的抑制作用。陈皮醇提物浓度高于0.9%时，菌丝体不生长，产生明显的抑制作用。当归醇提物在1.2%时，对菌丝体生长产生抑制作用，菌丝体生物量下降，浓度高于1.2%时，菌丝体不生长，产生明显的抑制作用。

图2　不同浓度中药醇提物对牛樟芝生物量的影响Fig.2　Effects of ethanol extracts of different Chinese herb medicine on production of biomass

2.3　不同浓度中药水提物对牛樟芝菌丝体总三萜含量的影响

不同浓度中药水提物对牛樟芝菌丝体总三萜含量的影响见图3。

图3　不同浓度中药水提物对牛樟芝菌丝体总三萜含量的影响Fig.3　Effects ofwater extracts of different Chinese herbmedicine on the triterpenoids production

从图3可以看出，不同浓度中药水提物均能不同程度提高牛樟芝菌丝体总三萜含量。连翘醇提物对总三萜含量的增加有明显的促进作用，增加量可达3倍～4倍，而且随着浓度的升高，促进作用增强。枸杞水提物对总三萜含量均有促进作用，但是相较连翘来说促进作用较弱，而且随着浓度升高，促进作用减弱。薏苡仁水提物只在浓度为0.3%、0.9%、2.1%、2.4%时，对总三萜含量有较小的促进作用，其他浓度均产生抑制作用。而陈皮水提物只在浓度为2.1%时，对总三萜含量有促进作用，其他浓度均产生不同程度的抑制作用。当归醇提物对总三萜含量的促进作用较小，但未产生明显的抑制作用。蒲公英对总三萜含量在低浓度时促进作用较为明显。

2.4　不同浓度中药醇提物对牛樟芝菌丝体总三萜含量的影响

不同浓度中药醇提物对牛樟芝菌丝体总三萜含量的影响见图4。

由图4可以看出，不同中药各浓度的醇提物对牛樟芝总三萜含量均有不同程度的促进作用。连翘醇提物对总三萜含量的促进作用最大，在浓度为0.9%时，促进作用已经达到了对照的4倍～5倍，浓度1.2%～2.4%时促进作用保持平稳。蒲公英对牛樟芝总三萜含量的促进作用相较连翘来说较小，但是其也能达到对照的1倍～2倍，在浓度为0.6%时，促进作用最明显，从浓度为1.2%时开始，产生稳定的促进作用。其他中药醇提物，除去菌丝体不生长的，所得到的样品对总三萜含量均产生促进作用，但效果不是特别明显。

3　讨论

中药中的一些成分可能促进牛樟芝菌丝体的生长，而另一些成分可能抑制牛樟芝菌丝体的生长。中药本身含有多种活性成分，其中的一些成分可以提高牛樟芝菌丝体总三萜含量。

枸杞、陈皮、薏苡仁、连翘、当归、蒲公英这六种中药的水提物和醇提物对牛樟芝菌丝体的生长有不同程度的促进和抑制作用。除薏苡仁在较低和较高浓度时对菌丝体生长有抑制作用外，其他中药均有不同程度的促进作用。连翘和蒲公英的醇提物对菌丝体生长有明显促进作用，其余中药在个别浓度有不同程度的抑制作用。中药水提物和醇提物对菌丝体生长的促进作用无明显的差别。中药醇提物对总三萜含量的影响比水提物要大，连翘和蒲公英尤为明显，产生明显的促进作用，而其他中药醇提物在不同程度均有较小的促进作用，这些试验结果可能与中药中含有促进总三萜分泌的化学物质有关，也可能与中药中本身总三萜含量较高有关，其作用机制需要进一步研究。

但是，中药提取物的添加对于牛樟芝液体发酵提高三萜类物质产量提供了创新性的方法，虽然其中的机理还有待进一步的研究，但是已经有了合适的方法来解决液体发酵三萜含量低的问题。采用外源添加物来提高代谢产物的生物合成量或许将成为食（药）用菌发酵的新策略和新方法[9]。

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