，，，　

中国是仅次于印度和印尼的结核病高负担国家，耐多药肺结核疫情较为严峻[1]。卡那霉素、阿米卡星及卷曲霉素3种氨基糖苷类药物是治疗耐多药肺结核的核心药物，作用机制都是与结核分枝杆菌核糖体结合，阻碍细菌蛋白质合成。有研究显示，结核菌的rrs、tlyA、eis、gidB基因突变与氨基糖苷类药物耐药相关[2]。国内耐多药结核分枝杆菌的主要基因型是北京基因型，但是北京基因型是否与耐药相关一直存在争议[3-5]。本研究通过RD105缺失基因检测法[6]鉴定宁波地区耐多药结核分枝杆菌临床分离株基因型，并对氨基糖苷类药物耐药相关基因进行突变特征分析，为本地区耐多药肺结核的有效防控提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源用于检测的106例耐多药结核分枝杆菌临床分离株来源于宁波地区11个县(市)、区2014-2016年耐药监测期间收集的痰培养阳性菌株，经菌种鉴定及一线抗结核药物耐药检测确定为同时耐异烟肼和利福平的耐多药临床分离株。结核分枝杆菌H37RV标准株来源于中国疾病预防控制中心。

1.1.2试剂来源分离培养、菌种鉴定及药敏试验培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司。结核分枝杆菌DNA提取、PCR扩增及基因测序相关试剂及技术服务购自上海桑尼生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株的分离培养、菌种鉴定按照《结核病诊断实验室检验规程》[7]进行。药物敏感性检测采用WHO/IUATLD《耐药监测指南》推荐的1%比例法对耐多药结核分枝杆菌菌株进行卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)3种氨基糖苷类药物的耐药性检测，含药培养基中药物终浓度分别为Km 30.0 μg/mL、Am 30.0 μg/mL、Cm 40.0 μg/mL。耐药百分比=(含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数)×100%，以耐药百分比大于1%定义为耐药。

1.2.2结核分枝杆菌基因组DNA制备取一接种环L-J培养基上生长状态良好菌落溶于400 μL TE(PH 8.0)中，震荡混匀后沸水浴15 min，12 000 g/min离心3 min取上清。

1.2.3北京基因型的鉴定根据北京基因型菌株RD105片段缺失特点，参照Chen[6]建立的检测方法进行检测。

1.2.4氨基糖苷类药物耐药相关基因PCR扩增和测序根据结核分枝杆菌H37RV标准株rrs(GeneID2700429)、tlyA(GeneID885396)、eis(GeneID885903)、gidB(GeneID886243)基因通过Primer Premier 5.0设计引物，见表1。采用20 μL PCR反应体系：模板1 μL(50ng)，2×Taq PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)，Forward Primer (20mmol/L) 1 μL，Reverse Primer (20mmol/L) 1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30s，57 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，30次循环，72 ℃ 3 min。

1.2.5统计学分析应用Seqman pro 7.1(version 7.1, DNA star Lasergene, Inc. USA)进行基因测序数据分析。参比序列为H37RV标准株DNA序列。采用SPSS16.0对北京基因型和非北京基因型菌株的氨基糖苷类药物耐药率、人群分布特征及耐药基因突变情况进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1耐药基因引物序列及其扩增片段
Tab.1Primer sequence of genes with drug resistance

基因(gene)引物序列(5′—3′)(primersequence)产物长度/bp(productlength)扩增区域(position)rrsF1TGGCCGTTTGTTTTGTCAGGR1CCGCACGCTCACAGTTAAG694上游67～627bpF2GTGCCAGCAGCCGCGGTAATR2CCGGCAGTCTCTCACGAGT651506～1156bpF3TGTCGTGAGATGTTGGGTTAR3GCCAACTTTGTTGTCATGC5721063～下游98bptlyAF1AGGCGCACGAGGTGTTGTTGR1AACGACAGGTCGGCCACTACCAGGT528上游57～470bpF2ATGTCGGATACGGCCAGCTGR2ACTTTTTCTACGCGCCGTGC555334～下游81bp表1(续)基因(gene)引物序列(5′—3′)(primersequence)产物长度/bp(productlength)扩增区域(position)eisF1GCGTAACGTCACGGCGAAATTCR1GTCAGCTCATGCAAGGTG567上游124～421bpgidBF1CGTAATGTCTCCGATCGAGCR1CTTTGATGGCGAGCATTCG46038～490bp

2　结　果

2.1不同基因型耐多药菌株耐药情况及人群特征分布106株耐多药结核分枝杆菌中，有83株78.3%(83/106)属于北京基因型，有23株21.7%(23/106)属于非北京基因型。83株北京基因型菌株中，有10株耐氨基糖苷类药物12.0%(10/83)；23株非北京基因型菌株对氨基糖苷类药物全部敏感，见表2。

表2不同基因型耐多药结核分枝杆菌氨基糖苷类药物耐药情况
Tab.2Distribution of Beijing genotype with second-line injectable drugs resistance among MDR-TB

耐氨基糖苷类药物种类Drugresistance北京基因型菌株数Beijinggenotype非北京基因型菌株数Non⁃Beijinggenotype耐Km+Am+CmResistanceofkanamy⁃cin，amikacinandca⁃preomycin30耐Km+AmResistanceofkanamy⁃cinandamikacin50耐Km+CmResistanceofkanamy⁃cinandcapreomycin00耐Am+CmResistanceofamikacinandcapreomycin10单耐KmResistanceofkanamy⁃cin10单耐AmResistanceofamikacin00单耐CmResistanceofcapreomy⁃cin00敏感Susceptibleofsecond⁃lineinjectabledrugs7323合计Total8323

注 Km：卡那霉素(kanamycin)；Am：阿米卡星(amikacin)；Cm：卷曲霉素(capreomycin)

治疗分类在不同基因型耐多药菌株中差异有统计学意义(χ2=4.318,P<0.05)，不同基因型耐多药菌株人群分布特征，见表3。

表3不同基因型耐多药结核分枝杆菌人群分布特征
Tab.3Characteristics of population among MDR-TB

人群特征Characteristicsofpopulation北京基因型(n=83)Beijinggenotype非北京基因型(n=23)Non⁃Beijinggenotype菌株数(%)number(%)菌株数(%)number(%)性别gender男man59(71．1)15(65．2)女woman24(28．9)8(34．8)年龄age<257(8．4)1(4．4)25～36(43．4)7(30．4)45～24(28．9)8((34．8)>6416(19．3)7(30．4)治疗分类treatment初治initialtreatment38(45．8)5(21．7)复治retreatment45(54．2)18(78．3)

2.2氨基糖苷类药物耐药相关基因突变特征10株耐氨基糖苷类药物的耐多药菌株中有4株发生耐药相关基因突变，突变率为40.0%，96株对氨基糖苷类药物敏感的耐多药菌株中有24株发生耐药相关基因突变，突变率为26.7%，差异无统计学意义(χ2=1.048,P>0.05)，见表4。96株对氨基糖苷类药物敏感的耐多药菌株中有5株发生rrs基因突变，突变类型为1株A1401G及4株A514C；有12株发生tlyA基因突变，突变类型均为T708G；有2株发生eis基因突变，突变类型为1株发生A10G、C12T、T14A、G15C、T37C多位点联合突变，1株发生A10T、C12T联合突变；有5株发生gidB基因突变，突变类型为4株发生115位缺失C碱基，1株发生A208C突变。

表4氨基糖苷类药物耐药相关基因突变特征
Tab.4Characteristics of gene mutations with second-line injectable drugs resistance among MDR-TB

氨基糖苷类药物耐药表型second⁃lineinjectabledrugsresistancerrstlyA耐药基因突变类型mutationlocieisgidB菌株数number耐Km+Am+Cm(Resistanceofkanamycin，amikacinandcapreomycin)NNNN3耐Km+Am(Resistanceofkanamycinandamikacin)A1401GNNN3A1401GT708GNN1耐Am+Cm(Resistanceofamikacinandcapreomycin)NNNN1单耐Km(Resistanceofkanamycin)NNNN1氨基糖苷类药物全敏感(Susceptibletosecond⁃lineinjectabledrugs)A1401GNNN1A514CNNN4NT708GNN12NNA10G+C12T+T14A+G15C+T37CN1NNA10T+C12TN1NNN115位缺C4NNNA208C1

注 Km：卡那霉素(kanamycin)；Am：阿米卡星(amikacin)；Cm：卷曲霉素(capreomycin)；N：无基因突变

3　讨　论

北京基因型结核分枝杆菌是全球广泛分布及流行的优势菌群，且是我国耐多药结核分枝杆菌主要基因型[3-5]目前针对北京基因型的流行与耐药结核病传播之间关系的研究存在争议，有的研究认为[8-9]，北京基因型菌株易对抗结核药物产生耐药，耐药因素间接促进了该基因型的流行。但部分研究显示[10-13]，北京基因型与非北京基因型菌株在耐药性方面无差异。本次研究表明纳入研究的耐氨基糖苷类药物的耐多药结核分枝杆菌均为北京基因型，提示北京基因型这一因素可能与本地区耐多药菌株对氨基糖苷类药物耐药有关。

有研究显示，编码16SrRNA的rrs基因突变与氨基糖苷类药物的耐药有关，且rrs基因1401位A-G的突变是氨基糖苷类药物3种药物之间交叉耐药的分子机制之一[14-15]。本次研究表明，同时耐卡那霉素与阿米卡星的5株耐多药菌株中有4株发生了1401位A-G的突变80.0%(4/5)，在氨基糖苷类药物敏感的耐多药菌株中发生了5株rrs基因突变5.2%(5/96)，差异有统计学意义(χ2=32.752,P<0.05)，与现有研究相符[16-17]。

gidB基因广泛存在于细菌基因组中，其编码蛋白是一种rRNA甲基转移酶，其靶点16S rRNA的G527正常甲基化对于氨基糖苷类药物与16S rRNA的稳定结合起到至关重要的作用。Okamoto[18]研究发现gidB基因突变会导致16S rRNA的530环不能得到修饰而引起氨基糖苷类药物耐药。gidB基因突变类型较为多样，存在点突变，缺失，插入等[19-20]。本研究显示，耐氨基糖苷类药物的耐多药结核分枝杆菌未发生gidB基因突变，相反在对氨基糖苷类药物敏感的菌株中存在gidB基因缺失和点突变情况。因此，gidB基因突变与氨基糖苷类药物的耐药关系值得商榷。同时由于gidB基因突变与低水平的链霉素耐药有关[21]，gidB基因突变的这部分菌株可能存在低水平的链霉素耐药。

结核分枝杆菌增强胞内存活基因(enhanced invracellular survival,eis)及其编码蛋白EIS(乙酰转移酶家族成员)可增强结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活能力。有研究显示，eis基因启动子区域突变与氨基糖苷类药物低水平耐药有关[2]。本次研究结果显示，耐氨基糖苷类药物的耐多药结核分枝杆菌中未发生eis基因启动子区域突变，相反在对氨基糖苷类药物敏感的耐多药菌株中有发生突变，提示eis基因启动子区域突变与氨基糖苷类药物耐药之间关系尚不明确。

tlyA基因的开放阅读框(ORF)内包含一个具有甲基转移酶活性的功能基团，在结核分枝杆菌rRNA甲基化过程中起到促进rRNA成熟，促进药物转运的作用。有研究显示，该基因发生断裂、缺失或突变，则细菌会对药物产生耐药性，且结核分枝杆菌该基因突变主要为点突变[22-23]。本研究表明，耐氨基糖苷类药物的菌株中仅有一株发生tlyA基因突变，且是和rrs基因的联合突变，在对氨基糖苷类药物敏感的菌株中却有12株发生了tlyA基因突变，提示tlyA基因突变与氨基糖苷类药物的耐药性关系无特异性。

综上所述，宁波地区MDR-TB中北京基因型与氨基糖苷类药物耐药相关，目前已知的耐药相关基因突变不能完全解释结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物耐药的原因，有关分子机制还需进一步研究。

参考文献：

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016[R]. Geneva: World Health Organization, 2016.

[2] Georghiou S, Magana M, Garfein R, et al. Evaluation of genetic mutation associated withMycobacteriumtuberculosisresistance to amikacin, kanamycin and capreomycin: a systematic review[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e33275. DOI: 10.1371/journal.pone.0033275

[3] Chen Q, Pang Y, Liang Q, et al. Molecular characteristics of MDRMycobacteriumtuberculosisstrains isolated in Fujian, China[J]. Tuberculosis(Edinb), 2014, 94(2): 159-161. DOI:10.1016/j.tube.2013.03.004

[4] Zhao M, Li X, Xu P, et al. Transmission of MDR and XDR tuberculosis in Shanghai, China[J]. PLoS One, 2009, 4(2): e4370. DOI: 10.1371/journal.pone.0004370

[5] Yuan X, Zhang T, Kawakami K, et al. Genotyping and clinical characteristics of multidrug and extensively drug-resistant tuberculosis in a tertiary care tuberculosis hospital in China[J]. BMC Infect Dis, 2013, 13(2): 315-318. DOI: 10.1186/1471-2334-13-315

[6] Chen J, Tsolaki AG, Shen X, et al. Deletion-targeted multiplex PCR( DTM-PCR) for identification of Beijing/W genotypes ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Tuberculosis, 2007, 87(5): 446-449. DOI: 10.1016/j.tube.2007.05.014

[7] China Anti-tuberculosis Association Foundation Committe. Laboratory testing procedures for tuberculosis diagnosis[M]. Beijing: China education culture publishing House, 2006. (in Chinese)

中国防痨协会基础委员会.结核病诊断实验室检验规程[M].北京：中国教育文化出版社，2006.

[8] Pang Y, Zhou Y, Zhao B, et al. Spoligotyping and drug resistance analysis ofMycobacteriumtuberculosisstrains from national survey in China[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e32976. DOI: 10.1371/journal.pone.0032976

[9] Parwati I, van Crevel R, van Soolingen D, et al. Possible underlying mechanisms for successful emergence of theMycobacteriumtuberculosisBeijing genotype strains(Review) [J]. Lancet Infect Dis, 2010, 10(2): 103-111. DOI: 10.1016/S1473-3099(09)70330-5

[10] Zhang Z, Lu J, Wang Y, et al. Prevalence and molecular characterization of fluoroquinoloneMycobacteriumtuberculosisisolates in China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(1): 364-369.DOI: 10.1128/AAC.01228-13

[11] Yang C, Luo T, Sun G, et al.MycobacteriumtuberculosisBeijing strains favor transmission but not drug resistance in China[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55(9): 1179-1187. DOI: 10.1093/cid/cis670

[12] Li DQ, Xia XS, Song YZ, et al. Genetic genotyping techniques forMycobacteriumtuberculosisand the application[J].Chin J Zoonoses,2016, 32(1): 76-82.DOI: 10.3969/j.issn.1002-694.2016.01.016 (in Chinese)

李道群，夏雪山，宋玉竹，等.结核分枝杆菌分子分型技术的研究和应用[J]. 中国人兽共患病学报，2016,32(1):76-82.

[13] Wang ZF, Li B, Jiang MX, et al. Investigation on spoligotyping and phenotypes of drug resistance for four first-line drugs in 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai, China[J]. Chin J Zoonoses, 2017, 33(4): 332-336. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.008 (in Chinese)

王兆芬，李斌，蒋明霞，等.青海省251株结核分枝杆菌Spoligotyping基因型与4种一线药物耐药表型的研究[J].中国人兽共患病学报，2017，33(4):332-336.

[14] Sirgel FA, Tait M, Warren RM, et al. Mutations in the rrs A1401G Gene and Phenotypic Resistance to Amikacin and Capreomycin inMycobacteriumtuberculosis[J]. Microb Drug Resist, 2012, 18: 193-197.DOI: 10.1089/mdr.2011.0063

[15] Zhang T, Fu J, Wang GZ, et al. Probe melting curve analysis for rapid detection of injectable second-line drug-resistant mutations inMycobacteriumtuberculosisstrains[J].Chin J Zoonoses, 2015, 31(5): 412-417. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.005 (in Chinese)

张婷，付军，王国志，等.探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变[J]. 中国人兽共患病学报，2015，31(5):412-417.

[16] Hu Y, Yang C, Pang Y, et al. Characteristics of gyrA and rrs gene mutations in multidrug-resistant tuberculosis isolates in Chongqing, China[J].Chin J Zoonoses, 2016, 32(11): 1001-1005. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.011.011 (in Chinese)

胡彦，杨春，逄宇，等.重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA与rrs基因突变特征分析[J]. 中国人兽共患病学报，2016,32(11):1001-1005.

[17] Hu Y, Hoffner S, Wu L, et al. Prevalence and genetic characterization of second-line drug resistant and extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisin rural China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(8): 3857-3863. DOI: 10.1128/AAC.00102-13

[18] Okamoto S, Tamaru A, Nakajima C, et al. Loss of a conserved 7-methylguanosine modification in 16S rRNA confers low-level streptomycin resistance in bacteria[J]. Mol Microbiol, 2007, 63(4): 1096-1106. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05585.x

[19] Spies FS, Ribeiro AW, Ramos DF, et al. Streptomycin resistance and lineage-specific polymorphisms inMycobacteriumtuberculosisgidB gene[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(7): 2625-2630.DOI: 10.1128/JCM.00168-11

[20] Wong SY, Lee JS, Kwak HK, et al. Mutations in gidB confer low-level streptomycin resistance in mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(6): 2515-2522. DOI: 10.1128/AAC.01814-10

[21] Wong SY, Javid B, Addepalli B, et al. Functional role of methylation of G518 of the 16SrRNA 530 loop by gidB inMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(12): 6311-6318. DOI: 10.1128/AAC.00905-13

[22] Engstrom A, Perskvist N, Werngren J, et al. Comparison of clinical isolates and in vitro selected mutants reveals that tlyA is not a sensitive genetic marker for capreomycin resistance inMycobacteriumtuberculosis[J]. J Antimicrob Chemother,2011, 66: 1247-1254. DOI: 10.1093/jac/dkr109

[23] Jureen P, Angeby K, Sturegard E, et al. Wild-type MIC distribution for aminoglycoside and cyclic polypeptide antibiotics used for treament ofMycobacteriumtuberculosisinfections[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(5):1853-1858. DOI: 10.1128/JCM.00240-10