贾刚，唐秋莎

(东南大学医学院 病理与病理生理学系，江苏 南京　210009)

恶性肿瘤在全世界范围内是威胁人类健康的主要杀手之一，因此如何更好地预防、治疗肿瘤一直是人们研究的热点。研究表明，外泌体作为重要的细胞间通讯介质在包括心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤在内的多种疾病中发挥重要作用，而肿瘤细胞较正常细胞能分泌更多的外泌体[1]，提示其与肿瘤的关系可能更为密切。越来越多的证据[2]表明，外泌体在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等各个过程扮演重要角色。这种角色是双重的[3]：一方面，外泌体可以作为“帮凶”促进肿瘤恶性生物学行为的发展进程；另一方面，外泌体也可以通过介导抗肿瘤免疫反应、促进肿瘤细胞的凋亡等机制发挥抑制肿瘤生长的作用。同时，作为一种天然的优良载体，外泌体可以被改造成靶向性药物载体，协助抗肿瘤药物或生物大分子发挥抗肿瘤作用，从而达到高效低毒杀伤肿瘤的效果。深入研究外泌体和肿瘤的相互作用机制，将为人们利用外泌体治疗肿瘤提供理论依据和新的思路。

1　外泌体概述

1.1　外泌体的发现和形成过程

1981年，Trams[4]等发现细胞分泌的囊泡具有胞外酶活性，第一次提出了外泌体的概念，1987年，Johnstone[5]等从体外培养的绵羊红细胞上清液中正式分离出这种小囊泡并命名为外泌体。随着人们研究的深入，现在认为几乎所有的活细胞都可以分泌外泌体，并广泛分布于人体各种体液中[6]。外泌体的具体形成机制目前仍然不是十分清楚，但现有研究认为，其形成过程与另一类细胞分泌的微囊泡小体——微泡(microvesicle，MV)不同[7]，外泌体是在细胞内形成的，细胞通过内吞作用产生小囊泡，小囊泡融合形成早期核内体(early endosome)，并逐渐变为晚期核内体(late endosome)。随着胞质内microRNA、酶分子、热休克蛋白等一些“货物”的进入，晚期核内体会产生很多小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，并逐渐演变成多泡体(multivesicular body，MVB)。最终这些多泡体被释放到胞外，形成大小更均一的微囊泡，即为外泌体。

1.2　外泌体的形态、结构和生物学特性

透射电子显微镜下外泌体多为茶托型或一侧凹陷的半球形，在体液中通常为球形结构，直径约为30～100 nm，在蔗糖密度梯度溶液中密度范围为1.13～1.19 g·ml-1[8]，其密度与细胞来源有关，随外泌体内蛋白含量而变化。外泌体的质膜含有丰富的胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、糖脂及含长饱和脂肪酰基的甘油磷脂链。外泌体也含有与其来源细胞相类似的蛋白质、脂质以及编码或非编码RNA等生物活性物质，在细胞之间物质交换过程中具有重要作用。

2　外泌体的提取方法

外泌体的提取有多种方法，每种方法各有优缺点，目前仍没有一种方法能做到兼顾外泌体的含量、纯度及生物活性。

2.1　离心法

是外泌体提取的常用方法，得到的外泌体量多，但是纯度不足，而且高速离心下的离心力可引起外泌体结构及大小的改变。按离心方式不同可以分为：差速超速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法。

差速超速离心法是最经典也是目前仍然很常用的外泌体提取方法，离心时，低速、高速交替进行，最终得到大小相近的囊泡颗粒，操作相对简单，但操作过程比较费时，得到的外泌体纯度也难以保证，此外，重复离心操作还有可能对外泌体造成破坏，影响其质量[13]。

超滤离心法是一种较新的提取方法，利用不同相对截留分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，即可获得外泌体，这种方法操作简单、高效，对外泌体的生物活性影响较小，但得到的外泌体纯度不理想。

蔗糖密度梯度离心法是一种区带分离法，在高达100 000 g的离心力作用下使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，样品中的外泌体将在1.13～1.19 g·ml-1的密度范围富集，得到富含外泌体的沉积物。此种方法提取到的外泌体纯度较高，但前期准备工作繁杂、耗时。

2.2　免疫磁珠法

其原理在于外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9)[2]，利用包被有标记物单克隆抗体的球型磁性微粒特异性结合外泌体，在磁力作用下分离得到外泌体。这种方法可以保证外泌体形态的完整性，特异性高、操作简便，且不需要昂贵的仪器设备，但是反应的溶液及抗体磁珠可能会影响外泌体的生物活性，要根据下游的实验进行选择，应用受限。

聚乙二醇(PEG)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)的问题，且颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此影响其应用。

2.4　试剂盒提取法

是近几年来新发展的一种方法，目前市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法进行分离纯化，也有的利用化合物沉淀法将外泌体沉淀出来。试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。

2.5　色谱法

该法是利用凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析方法，利用该法也可对外泌体进行分离，得到的外泌体在电镜下大小更均一，纯度也较高，但需要特殊的设备，应用不广泛。

3　外泌体在肿瘤治疗中的应用研究

外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA等物质，参与多种生理、病理过程，同时还具有低免疫原性和较好的包载能力，可以成为一种理想的治疗载体[14]，这都提示了其在疾病治疗中的潜在价值。外泌体在肿瘤治疗中的作用主要体现在以下几个方面：(1) 通过调节肿瘤微环境的免疫反应，影响肿瘤的生长；(2) 作为载体，携带治疗药物或生物活性物质到达肿瘤组织，发挥抑瘤作用；(3) 直接诱导肿瘤细胞凋亡。

3.1　以外泌体为基础的免疫治疗

3.2　外泌体作为抗肿瘤药物载体的应用

与细胞载体相比，外泌体也有明显优势[27]：(1) 外泌体纳米级别的粒径更有利于其在体内的分布，也更有利于到达靶细胞并通过膜融合或内吞作用进入细胞内释药，从而最大程度地发挥药物作用；(2) 静脉给药发生血管栓塞和微血管损伤的风险大大降低；(3) 性质稳定，更易于保存，还可以人为地改变其内容物的种类和数量[20,28]；(4) 更安全，载体应用没有异倍体性风险；(5) 可根据需要调节用量，不会像细胞载体那样增殖不受控制，而影响疗效带来更多的不良反应[29]。

3.3　外泌体直接诱导肿瘤细胞凋亡

4　外泌体应用于肿瘤治疗中的不足之处

如前所述，外泌体在肿瘤治疗中有诸多的独特优势，然而随着越来越多研究的开展和深入，也发现其存在的一些缺点和局限性。首先，无论哪种治疗作用，都要依赖于一定数量和质量的外泌体，而外泌体的获取，目前尚没有一种方法能够兼顾产量、纯度和生物活性[36]。其次，现阶段人们对外泌体性质和其对机体生理、病理状态的影响还存在很多认识上的不足，所以在活体应用时，其长期作用和安全性究竟如何，尚有待于进一步的观察、评价。再者，必须认识到外泌体是一把双刃剑，不同细胞来源和不同条件下产生的外泌体，对肿瘤的影响有可能是截然相反的，应用时要进行必要的筛选和诱导。最后，外泌体作为载体时，目前对外泌体载药的方法和产率的控制还不很成熟，包载后对外泌体自身会产生哪些影响也不十分明确，不同实验室之间在包载方式及后续检测上还没有达到标准化。活体应用时，为了提高治疗的靶向性，需要进行靶向性修饰，实现靶向性的方法还需要进一步探索、研究。

5　结　　语

外泌体已经为肿瘤治疗开辟了一个新的视角，同时也引来了一些的困惑和争议。作为免疫调节剂，外泌体可以替代源细胞发挥抗原呈递作用，并可成为肿瘤疫苗的来源，同时外泌体也可以帮助肿瘤细胞产生、维持免疫逃逸。作为载体，外泌体可以携带多种可用于肿瘤诊断和治疗的纳米材料、生物大分子等，经过适当膜修饰，还能够提高原有药物的抑瘤效果，但是活体应用时，在包载方法、靶向性以及长期疗效和不良反应方面还需要进一步研究、观察。作为凋亡的调节剂，虽然目前的研究结果不完全一致，但已有明确证据证明在适当的条件下，外泌体可明显促进肿瘤细胞的凋亡，发挥抑瘤效果。不过这种效果可能跟外泌体的产量和浓度以及肿瘤细胞的分化状态有关。总之，外泌体在肿瘤治疗中的应用研究，还存在一些不一致甚至是相互矛盾的地方，有很多新的领域需要探索，这正是外泌体自身的特点和目前对外泌体的认识不足造成的。对其性质和作用机制进行更为深入地研究，将为肿瘤的治疗带来更为光明的前景。

[参考文献]

[2] ZHANG X,YUAN X,SHI H,et al.Exosomes in cancer:small particle,big player[J].J Hematol Oncol,2015,8(1):83.

[5] JOHNSTONE R M,ADAM M,HAMMOND J R,et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles(exosomes )[J].J Biol Chem,1987,262(19):9412-9420.

[10] PETERSEN S H,ODINTSOVA E,HAIGH T A,et a1.The role of tetraspanin CD63 in antigen presentation via MHC class Ⅱ[J].Eur J Immunol,2011,41(9):2556-2561.

[12] LASSER C,ELDH M,LOTVALL J.Isolation and characterization of RNAcontaining exsomes [J].J Vis Exp,2012,(59):e3037.

[13] LOBB R J,BECKER M,WEN S W,et al.Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma[J].J Extracell Vesicles,2015,4:27031.

[21] FURLANI D,UGURLUCAN M,ONG L L,et al.Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cellsand intravital microscopy[J].Microvasc Res,2009,77(3):370-376.

[24] BATRAKOVA E V,KIM M S.Using exosomes,naturally equipped nanocarriers,for drug delivery[J].J controlled release,2015,219:396-405.

[30] RISTORCELLI E,BERAUD E,MATHIEU S,et al.Essential role of Notch signaling in apoptosis of human pancreatic tumoral cells mediated byexosomal nanoparticles[J].Int J Cancer,2009,125(5):1016-1026.