王颢潜 陈锐 李夏莹 王梦雨 刘鹏程

（1. 农业部科技发展中心，北京 100176；2. 天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300192；3. 中国农业大学植物保护学院，北京 100193）

转基因技术在农业领域的应用与发展十分迅猛，已成为世界各国农业科技竞争的焦点。据统计，在转基因作物商业化21 年间（从1996-2016年），全球转基因作物的商业化种植面积持续增长，累计达到了21 亿hm2，这使转基因生物技术成为近年来应用最为迅速的作物技术［1］。转基因生物技术给人类带来了巨大经济效益的同时也引发了社会关于转基因植物安全性问题的争议，鉴于食用安全长期效应无法确证等问题，当前的研究成果尚不能对转基因安全给出准确、全面的结论。为加强对转基因产品的管理，世界各国都在积极完善和落实相应的法律法规。但是，目前不同国家和地区的转基因法律法规、标识制度、阈值范围和管理方式上存在较大差异，对转基因产品的进出口检验、国际贸易互认等方面造成了较大的影。由此可见，转基因检测技术的需求是一直存在的，并随着转基因技术应用的快速发展显得尤为迫切。开发便捷、高效的转基因检测方法，尤其是精准的定量检测技术，建立相应的检测技术体系对促进转基因农业发展、保护我国农产品进出口贸易利益、满足转基因生物安全监管需求以及完善转基因标识管理制度等方面意义重大。目前国内外对转基因产品的检测技术根据检测原理的分为两类，即基于外源核酸的检测技术和基于外源蛋白的检测技术。本文就转基因产品成分检测技术的原理、优缺点、研究进展和发展方向做一简要概述，旨在促进我国转基因产品成分检测技术更好地适应当前转基因领域的发展和满足转基因生物安全监管的需求。

1 基于外源核酸的检测技术

核酸是绝大多数生命体的遗传物质，具有较高的稳定性和普遍性，因此以脱氧核糖核酸（DNA）为靶标的检测技术是目前最成熟、应用最广泛的转基因产品检测技术［2］。根据外源DNA片段序列特征和插入位置的不同，核酸检测可以对筛选元件特异性、基因特异性、载体构建特异性和转化事件特异性四个方面进行检测［3-5］。基于外源核酸的转基因检测技术主要有：定性PCR技术、定量PCR技术、等温扩增技术和基因芯片技术等。

1.1 定性PCR技术

定性PCR也称为普通PCR（Conventional PCR），是一种基于聚合酶链式反应的检测技术，是目前应用于转基因检测最广泛的方法［6］。此法不受材料加工程度的影响，可以对种子到终产品的转基因成分进行定性检测，且灵敏度高、操作简便，成为许多国家用于市场筛查转基因成分的首选方法，如巴西［7］、科威特［8］、伊朗［9］、沙特阿拉伯［10］、约旦［11］、塞尔维亚［12］及叙利亚［13］等国家。

普通PCR单次反应只能检测特定靶序列，无法满足大量、快速的转基因产品检测需求。以常规PCR方法为基础改进PCR方法也得到了广泛的应用。例如，多重PCR（Multiplex PCR）在检测通量和成本控制方面具备优势，近年来也被广泛关注和深入研究。Datukishvili等［14］针对转基因大豆开发了4重PCR体系，能够同时检测CaMV35S 启动子、NOS终止子、epsps基因与大豆内源基因lectin，还开发了转基因玉米3重PCR体系，能够同时检测启动子、cry1Ab基因和玉米内源基因zein，该方法特异性良好，并且灵敏度均能达到0.1%；Harikai等［15］结合多重PCR与引物延伸的方法，将生物素标记的核酸 dUTP混入到引物延伸产物中，可直接光学检测8重PCR扩增产物，检测时间短，灵敏度可达1%；Mano等［16］将多重PCR与多重连接酶扩增反应（Multiplex ligase chain reaction，LCR）偶联，针对7个转基因元件和3个内源基因开发出了高效的多重转基因检测方法；Patwardhan等［17］开发了多重PCR-毛细管电泳方法可同时检测转基因棉花MON531、转基因马铃薯EH 92-527-1、转基因玉米Bt176、转基因玉米GA21和转基因油菜GT73 canola，检测低限为0.1%。

对于普通PCR灵敏度不高，对含量低、成分复杂和被严重破坏的DNA样品难以准确检测的缺点，在普通PCR的基础上开发出了巢式PCR（Nested PCR）和半巢式PCR（Semi-Nested PCR）技术。该技术的原理是在扩增产物的片段上引入新的引物，通过二次扩增反应对某段序列进行检测，以提高检测的准确度和灵敏性。敖金霞等［18］建立了适用于转基因大豆、玉米及水稻深加工产品的五重巢式PCR 技术，检测灵敏度为0.005%；闫伟等［19］建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品，此方法的相对检出限达到0.01%，绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数，比普通PCR提高了5倍。

随着定性PCR技术的发展，热不对称交错PCR、连接介导PCR和反向PCR在转基因分子鉴定和单链DNA制备等方面开始广泛应用［20-21］。

1.2 定量PCR技术

目前，越来越多的国家通过设定阈值对转基因产品进行标识管理，转基因成分含量超过设定阈值的转基因产品必须强制性标识，如欧盟为0.9%，澳大利亚、巴西为1%，马来西亚、韩国为3%，日本、中国台湾为5%［22-23］。随着世界各国转基因产品标识制度的发展和完善，应用定量PCR技术对转基因产品进行定量标识将越来越广泛［24］。定量PCR技术主要有竞争性定量PCR技术（Competitive quantitative PCR，QC-PCR）、实时定量 PCR技术（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR） 和数字PCR技术（Digital PCR，dPCR）3种。

1.2.1 竞争性定量PCR技术 竞争性定量PCR通过向PCR反应体系中加入与目标DNA具有相同扩增效率和引物结合位点的竞争模板，同时以不同稀释梯度的竞争模板建立标准曲线，从而计算目标DNA的含量［2，23］。Garcíacañas等［25］将 QC-PCR 方法与毛细管电泳激光诱导荧光技术巧妙结合，实现了玉米Bt176品系的定量检测；Mavropoulou等［26］研究证明QC-PCR比实时定量PCR灵敏度高且探针价格低廉。QC-PCR技术的难点在于竞争模板的设计。

1.2.2 实时定量PCR技术 实时定量PCR通过荧光标记实时监控目的片段的扩增，根据待测物起始浓度与Ct（Threshold Cycle）值线性相关的原理，从而实现靶标基因的精确定量，已广泛应用于转基因产品的定量检测［27］。qPCR试验中，选择恰当的内源基因并验证特异引物是定量检测的关键因素［28］。目前，qPCR检测技术已被广泛应用于大豆［29］、玉米［30］、水稻［31］、菜豆［32］、棉花［33］、茄子［5］、木瓜［34］和酿酒酵母［35］的转基因成分检测，具备良好的特异性和较高的灵敏度。随着规模化和快速化转基因检测的需求，多重qPCR技术得到了发展。Dörries等［36］针 对 P-35S、T-NOS、bar和 FMV35S设计了多重定量PCR预混液，检测低限均能达到10个拷贝，并且在41个非转基因植物中验证其特异性良好；Li等［37］设计了四重定量PCR可同时检测转基因棉花GHB119 的T304-40的事件特异性与外源基因Cry2Ae，检出限为10个拷贝，定量限为20-25个拷贝。qPCR具有操作简便、灵敏度高，但成本较高，存在重现性较差的问题。

1.2.3 数字PCR技术 数字PCR是一种基于泊松分布原理的针对单分子目标DNA的绝对定量技术［38］。相对qPCR技术，dPCR不需要对每个循环进行实时荧光测定，也不需要Ct值来定量靶标。dPCR通过将反应试剂平均分配到几万至上千万个单元中，从而使靶标DNA稀释到单分子水平。扩增结束后，通过直接计数或泊松分布计算得到样品的原始拷贝数，因此其不受扩增效率的影响，也不必使用内参基因和标准曲线，具有极高的准确度和重现性。目前，dPCR 已应用于转基因玉米［39］、水稻［40］、大豆［41］及深加工产品［42］中的定量检测中。

当前的dPCR技术平台主要有两种，一种是基于固态平台开发的芯片式数字PCR技术，由Fluidigm公司基于集成流体通路（IFC）芯片与Life Technologies的OpenArray为代表；另一种是基于液体微滴的数字PCR技术，由Bio-Rad公司和RainDance公司产品为代表。Li等［43］基于Fluidigm公司开发的动态芯片技术建立了高通量数字PCR转基因检测方法，可同时检测48个样本中的48个靶标基因，包括7个转基因元件、36个事件特异性基因和5个内源基因，为克服基因组DNA上样拷贝数稀少的问题，该研究还利用8-14个循环的预扩增来优化检测方法，最终的检测低限为0.05 ng。

dPCR特异性强、准确度高，常用来确定转基因标准物质的量值。Corbisier等［44］利用dPCR技术对转基因玉米MON810的标准物质进行拷贝数测定，结果表明dPCR相对qPCR在绝对定量方面具备优势，可用于标准物质的校正；Liang等［45］利用Fluidigm平台对转基因水稻kefeng6的质粒参考物质进行检测，同样证实数字PCR可用于转基因标准物质的拷贝数验证。目前，美国国家标准与技术研究 院（National Institute of Standards and Technology，NIST）已开发出全球首例由dPCR校准的DNA标准物质，可用于人类巨细胞病毒的溯源和检测结果比对［46］。

最新的研究表明，dPCR技术还是检验外源插入基因拷贝数和纯合性的有效方法。Glowacka等［47］在转基因烟草中比较了Southern blot、热不对称交错PCR、定量PCR和数字PCR等方法，用于分析插入的T-DNA拷贝数、位点复杂性和纯合性，结果表明dPCR与Southern blot结果一样可靠，并且在试验操作上更加快速和便捷。虽然目前来看dPCR技术存在成本昂贵等缺陷，但其绝对定量的属性在转基因检测中有着广阔前景。

1.3 等温扩增技术

等温扩增技术是指在一个恒定温度下，通过不同活性的酶和各种特异性引物来实现DNA扩增的方法，相对于PCR扩增技术具有快速、高效、特异的优点且无需专用设备，在临床和现场快速诊断中应用广泛。主要方法有：环介导等温扩增（LAMP）、滚环核酸扩增（RCA）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、链替代扩增（SDA）和解链酶扩增（HAD）［48］等。

在转基因检测领域最常用的主要是LAMP技术，它是由Notomi等发明的一种等温核酸扩增技术［49］。基本原理是针对目标DNA的6个不同区域设计4条不同的引物，依赖链置换DNA聚合酶，在恒温下进行扩增反应，循环不断地产生不同长度的DNA片段，反应结果可通过凝胶电泳、焦磷酸镁沉淀、实时比浊法、特定荧光染料等来判断［24，48］；周杰等［50］建立了DAS-81419-2、FG72等6种转基因大豆的LAMP检测方法；Chen等［51］开发的针对转基因水稻TT51-1的事件特异性检测方法中，将钙黄绿素和锰离子添加至LAMP体系中，可实现一步可视化检测，方法灵敏度达10-20个拷贝。

最近的研究显示，将LAMP技术与其他技术结合是转基因检测的发展趋势。Cheng等［52］将LAMP与DNA酶横向流动检测试纸条技术结合，用于检测复合性状转基因大豆DP305423×GTS 40-3-2，该方法具备良好的灵敏度和特异性；Shao等［53］开发了特殊的毛细管柱装置，将LAMP特异引物固定于毛细管壁的内壁后，一次上样并恒温扩增后，可直接可视化检测10个靶标基因的扩增结果，该方法操作简便、通量高，可用于田间快检和大规模转基因筛查工作；Morisset等［54］将NASBA技术与芯片技术相结合，开发了多重转基因检测芯片，该方法的特异性与灵敏度与qPCR方法相当，定量检测的线性范围为0.1%-25%，是非常有潜力的高通量检测方法。LAMP技术对设备要求低，具有直观、高效的特点，已经成为出入境检验检疫等行业标准转基因成分检测的一种指定方法，未来仍需克服假阳性较高、引物设计要求高等不足。

1.4 基因芯片技术

基因芯片技术（Gene chip）是基于核酸杂交的一项高通量检测技术，利用固体在基质表面的上千个特定探针与标记的样品进行杂交，通过分析杂交信号，能够一次性准确地对样品中不同种类的DNA序列进行定性、定量的筛查，已被广泛应用于转基因检测等许多领域。Tengs等［55］设计了包含约4万个探针的Tilling芯片，涵盖绝大多数植物转化用的载体序列，可用于筛查未知转化事件；Turkec等［56］对3个转基因大豆和9个转基因玉米开发检测芯片，筛选出33个探针可用于区分12个GMO事件，并开发了一套数据算法来实现最大的检测通量和灵敏度。基因芯片技术满足当前转基因高通量、自动化检测的需求，但由于其成本较高、芯片合成复杂、背景干扰严重等不足，一定程度影响了该技术的广泛应用。

2 基于外源蛋白的检测技术

基于外源蛋白的转基因检测技术是以免疫分析技术为基础的对转基因产品的外源表达蛋白进行定性和定量检测的一种技术。常见的方法主要包括酶联免疫吸附技术、Western blot 检测技术和试纸条技术等。

2.1 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）通过抗原和抗体的可视免疫反应来检测和鉴定目标蛋白，主要包括双抗夹心法、直接法、间接法，其中灵敏度最高的双抗夹心法应用最为广泛［57］。Guertler等［58］利用双抗体夹心ELISA检测法实现了对转基因产品中Cry1Ab蛋白的检测，最低检测限为0.4 ng/mL，特异性高于实时荧光PCR方法。目前，我国对已获生产应用安全证书的转基因抗虫棉的衍生品系进行安全评价检测时，采用ELISA检测技术对抗虫棉不同组织部位中Bt蛋白的表达量进行检测，从而对抗虫棉品种的抗性能力进行科学评价。新近发展起来的PCR- ELISA技术，结合了PCR方法的高效性和ELISA方法的高特异性，在转基因检测领域中极具潜力。利用PCR-ELISA方法检测转基因大豆的灵敏度比欧盟用的PCR方法高5-10倍，而且有效的避免了假阳性现象的产生［59］。

2.2 Western blot检测技术

Western blot检测技术本质是一种蛋白质转移电泳技术，其原理是将聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，利用抗体反应和显色酶反应实现对转基因产品中外源蛋白的有效检测。Wang等［60］利用Western blot 技术检测到了转基因烟草外源EPSPS 蛋白的表达；Yates等［61］利用Western blot技术对转基因种子的检出限能达到0.25%，深加工产品可达到1%，灵敏度较高。虽然Western blot技术操作较为繁琐，也无法满足快速高效检测需求，但其可以有效地检测转基因产品中的不可溶蛋白。

2.3 试纸条技术

试纸条技术是基于免疫层析的一种快速检测技术，较之ELISA 法更为简便、快速，可在5-10 min的时间内现场观测结果，在转基因产品大规模快速筛查检测中应用广泛。许多公司针对不同转基因植物中特异表达的外源蛋白，开发出大量特异的免疫层析试纸条，如检测孟山都公司转基因Roundup Ready大豆和油菜中CP4-EPSPS蛋白的试纸条、Starlink玉米中Cry9c蛋白的试纸条等［62］。中国农科院油料所研制的Cry1Ab/Cry1Ac试纸条，成本为进口产品的40%，灵敏度等性能参数与进口试纸条相当，是农业部推荐使用的产品之一。由于试纸条技术具备操作简便快速、特异性强、成本低廉等优点，其发展和应用较为迅速。Santos等［63］研发了一种可以同时检测Cry1Ac和Cry8Ka5杀虫蛋白的试纸条，检出限为0.06 μg，可以很好地区分抗虫转基因植物和非转基因植物；Mutoni等［64］用PCR法和试纸条对肯尼亚市场上的120份玉米样品进行转基因检测，两种方法结果一致；张欣等［65］采用试纸条法检测水稻样品，结果准确，测试时间短于qPCR法，适用于水稻及其产品的现场检测和大规模初筛；张裕君等［66］将PCR技术与试纸条技术相结合建立了一种可视化检测转基因黑曲霉的方法，该方法比传统凝胶电泳法快捷且灵敏度高出10倍以上。随着试纸条技术不断完善，克服假阴性、假阳性和背景色较重的问题，提升灵敏度和实现多元检测，试纸条在转基因检测中将发挥更重要的作用。

3 展望

综上所述，基于外源核酸的检测技术准确性高、稳定性好、操作简便，但转基因产品中的多糖、蛋白等杂质会对检测结果产生一定的干扰，而且DNA的提取质量对结果影响较大；基于外源蛋白的检测技术灵敏度高、结果可靠、重复性好，但受后期加工环节的影响，而且外源蛋白在不同部位和不同时期的不同表达量会对检测结果造成影响。在实际检测过程中，并非任何一种检测方法对某种转基因产品的检测都行之有效，每种方法都有其优缺点和适用范围，选择检测方法时应根据检测的需要并结合转基因产品的类型和特点，选择最有效的方法或技术组合［67］。随着商业化转基因农作物品系的快速增长，以及转基因生物安全评价与监管需求，转基因检测日趋多样化、复杂化。除以上介绍的方法之外，电化学发光分析技术、色谱技术、近红外光谱检测技术、生物传感器技术、生物分子互作技术以及基于一些成熟技术建立起来的试剂盒技术、内标基因种属特异性检测技术等在转基因产品的实际检测中都有所应用。

随着基因编辑和RNAi等转基因新技术的应用与推广，转基因产品呈现出多样化发展的趋势。加之当前可用的转基因分子特征信息十分有限，相关数据库也并不完善，现有的转基因检测技术体系正面临着巨大挑战。建立快速、精准、低成本、高通量的转基因检测技术与方法已成当务之急。通过转基因生物新品种培育科技重大专项科技项目的实施，我国转基因检测技术发展将越来越快。大力发展符合国情的、科学可靠的转基因检测技术，掌握核心技术，抢占领域高地，不仅关乎国家利益，而且对推动转基因产业发展及维护环境和食品安全方面都具有十分重要的意义。

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