张飞飞, 杨运文, 董慧青, 尚广东*

1.徐州医科大学麻醉学院, 江苏省麻醉学重点实验室, 江苏 徐州 221004;2.南京师范大学生命科学学院, 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室, 南京 210023

重组工程是指利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组在生物基因组中进行基因克隆或DNA改造的一种基因工程技术[1,2]。目前广泛使用的重组酶基因来源于λ噬菌体的Red重组系统，包括exo、bet和gam基因，分别编码Exo、Beta和Gam 3种蛋白质分子。Exo蛋白是一种5′→3′DNA外切酶，结合在双链DNA的末端得到3′端突出的DNA分子[3]；Bet蛋白是一种单链DNA结合蛋白，结合在由Exo消化产生的3′单链DNA末端，促进该单链DNA末端与互补链退火和体内重组[4]；Gam蛋白可与RecBCD结合抑制其降解DNA的活性，协助Exo和Beta完成同源重组[5]。Red重组已经发展成为一套比较成熟的重组系统，以方法简便和重组效率高著称。作为一种高效的打靶技术，其在功能基因组学方面的研究越来越广泛。但是Red重组系统也有缺点，利用Red 重组系统敲除目标基因时有外源片段残留，如在敲除位置残留一个FRT位点序列[6]。而这些冗余序列的存在可能干扰基因组的总体结构、影响其他基因的表达，如极性效应(即一个转录单位中的一个无义突变能抑制转录单位中随后基因的转录)，也给后续的基因修饰带来困难。为实现不含任何冗余碱基的大肠杆菌基因的敲除，即无痕敲除，Yu等[7]利用Red同源重组系统和核酸内切酶 I-SceI的筛选作用，通过两步连续的同源重组成功实现无痕敲除，但是该方法仍需要通过PCR、限制性酶酶切、连接酶介导的DNA片段连接等步骤构建400～500 bp的用于基因修饰的同源片段。……