沈彤，张赛，涂悦，陈旭义，吴焕成

[1.天津中医药大学第一附属医院 推拿科，天津 300193；2.武警后勤学院

附属医院脑科中心（天津市神经创伤修复重点实验室），天津 300162；3.天津市北辰医院 脑系科，天津 300400]

随着社会经济、交通运输业等的快速发展，颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）的发生率也逐年增高，其高致残率和致死率给社会和家庭可造成严重负担。而TBI后的继发性脑水肿是导致患者残疾和死亡的重要原因之一，因此有效控制脑水肿是治疗TBI的关键手段[1]。近年有研究显示，十二井穴放血对改善TBI后脑水肿有一定疗效，但相关机制尚不明确。线粒体是机体能量代谢的重要场所，线粒体功能障碍与细胞毒性脑水肿以及神经功能损伤程度密切相关，这提示线粒体或许是井穴放血疗法发挥脑保护作用的重要靶点之一[2-4]。本实验拟通过皮质撞击致伤（controlled cortical impact injury，CCI）构建不同损伤程度TBI大鼠模型，探讨井穴放血疗法对脑水肿的影响，并进一步检测线粒体生物合成相关基因表达以及线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数的变化，从而为研究井穴放血疗法治疗TBI的机制提供更多基础支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雄性SD大鼠56只，7～8周龄，体重220～250 g，购自军事医学科学院动物实验中心。RNA/DNA共提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），实时荧光定量PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

电子控制性脑皮质撞击仪（eCCI，美国Custom &Design公司），Nano Drop 2000（美国Thermo Fisher Scientific公司），real-time PCR仪（Step One Plus，美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及TBI模型的复制将大鼠按随机数字表法随机等分为7组，即轻度TBI组（L组）、轻度TBI加井穴放血组（L+B组）、中度TBI组（M组）、中度TBI加井穴放血组（M+B组）、重度TBI组（H组）、重度TBI加井穴放血组（H+B组）和对照组，每组8只。各TBI组经1%戊巴比妥钠按40 mg/kg麻醉后，暴露右侧顶骨，颅钻钻孔直径约4.5 mm，调整eCCI打击臂至与垂直方向呈20°夹角，使用3 mm直径打击帽打击大脑皮质。参数如下：打击速率为5 m/s，打击后最低点持续时间为0.2 s，轻度、中度、重度TBI组的打击深度分别为1、3和4 mm[5]。对照组仅开骨窗后缝合皮肤，不进行打击。

1.3.2 十二井穴放血用1 ml注射器针头于大鼠双侧前肢趾端的十二井穴点刺出血，出血量为每穴10 μl，每12 h进行1次放血，穴位定位方法采用比较解剖学，参考人体相应穴位解剖标志。

1.3.3 神经功能损伤评分及标本采集7组大鼠均于术后第72 h行mNSS评分[6]，分数越高说明症状越严重，最严重为18分，0分为正常。评价完成后采用颈椎离断法处死大鼠，各组均取损伤灶周边同一部位脑皮质约10 mg，进行后续DNA和RNA的提取，剩余脑组织进行干湿比重测量。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定相关基因表达及线粒体DNA拷贝数按照说明书，提取脑组织的基因组DNA和总RNA，并将RNA逆转录成cDNA。qRT-PCR测定线粒体生物合成相关基因的表达变化，包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1alpha，PGC-1α）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），以及可代表mtDNA拷贝数的线粒体单拷贝基因环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）。方法如下：配制PCR反应体系，包括2×Ultra SYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因组DNA 50 ng，以及相应体积的引物和灭菌双蒸水，每个基因设置3个重复孔。反应条件采用两步法：95℃10 min预变性，随后95℃变性15 s，60℃退火延伸60 s，共40个循环测定Ct值，以0.3℃梯度逐步升温行熔解曲线分析。应用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.3.5 脑组织含水量测定取脑后仅保留左右大脑半球，立即称重，所得质量为湿重。随后将大脑放入烘箱中，75℃烘烤48 h，称重后所得质量为干重。含水量=（湿重-干重）/湿重。

表1 设计引物序列

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能损伤评分

TBI后大鼠的mNSS评分均高于对照组，且随着TBI严重程度的增加，评分依次增高（P＜0.05），且轻、中度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后mNSS评分与相应的L和M组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同组别各指标比较 （n =8，±s）

表2 不同组别各指标比较 （n =8，±s）

组别 mNSS评分/分 PGC-1α TFAM mtDNA拷贝数 脑组织含水量L 组 5.75±1.751） 2.56±0.711） 2.40±0.971） 5.50±1.421） 0.788±0.0161）L+B 组 4.00±1.191）2） 3.13±0.871） 3.07±0.721） 7.82±3.201）2） 0.776±0.0121）M组 8.88±1.731） 2.49±0.781） 2.76±1.351） 5.03±3.361） 0.791±0.0091）M+B 组 6.63±2.131）2） 3.74±1.011）2） 3.41±1.481） 7.42±2.901）2） 0.780±0.0071）2）H组 10.63±2.071） 4.61±2.041） 3.64±0.711） 3.67±1.821） 0.797±0.0121）H+B 组 10.00±1.201） 5.47±1.951） 4.48±2.321） 4.00±1.831） 0.799±0.0151）

续表2

2.2 各基因表达及mtDNA拷贝数变化

TBI模型大鼠的PGC-1α和TFAM基因表达水平以及mtDNA拷贝数均高于对照组（P＜0.001）；轻度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后，mtDNA拷贝数高于相应的未应用放血疗法的大鼠（P＜0.05），中度TBI组大鼠在应用放血疗法后PGC-1α基因表达水平和mtDNA拷贝数升高（P＜0.05），轻、重度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后，虽然PGC-1α和TFAM基因表达水平均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 脑组织含水量

TBI后各组大鼠脑组织含水量与对照组比较均增加，且中度TBI组大鼠在应用井穴放血疗法后脑组织含水量与相应的M组比较降低（P＜0.05），见表2。

3 讨论

脑水肿TBI后常见的并发症之一，常于发病后第2天达到高峰，主要由创伤造成的脑组织缺血、缺氧以及Na+-K+离子泵的功能障碍导致细胞水肿引起，其可造成颅内压急剧增高，从而进一步使脑的血液灌注减少，病情加重，甚至导致脑疝威胁生命[7]。井穴位于人体的四肢末端，是十二经脉气血起始之处，《医宗金鉴-刺灸心法要诀》中指出：“商阳主刺卒中风，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中冲、关冲、少泽、商阳，使气血流行，乃起死回生救急之妙穴”。放血疗法最早的记载可见于《黄帝内经》，如“刺络者，刺小络之血脉也”；“菀陈则除之，出恶血也”，并明确地提出刺络放血可以治疗癫狂、头痛、暴喑、热喘及衄血等病证，与单纯灸法比较，起除淤效果更佳。

本实验结果表明，井穴放血可有效减轻轻度和中度TBI大鼠神经功能损伤症状，并降低TBI后脑水肿的严重程度，提示TBI后应用井穴放血疗法可发挥脑保护作用。与苗笑梅和张静莎等的研究结果类似，苗笑梅等[8]发现，十二井穴刺络放血可以降低神经功能缺陷评分，减轻脑水肿，对创伤性大鼠脑组织有保护作用，张静莎等[9]也发现，手十二井穴放血有改善重型颅脑创伤患者意识状态的作用趋势，但上述两项研究均未深入探讨相关机制。细胞内线粒体可通过氧化磷酸化为细胞活动提供能量，当创伤导致线粒体功能障碍时，可引起细胞内乳酸堆积并影响Na+-H+交换，促进脑水肿的发生[10]。为此本课题组进而检测脑组织中线粒体生物合成相关基因表达及mtDNA拷贝数的变化，以期探索井穴放血疗法发挥脑保护作用的靶点。

结果表明，TBI后组织中mtDNA拷贝数增加，提示创伤在造成线粒体损伤后，mtDNA发生代偿性扩增。一方面，mtDNA是独立存在于细胞器中的环状基因组DNA，其在基因组之中的个数称为mtDNA拷贝数，由于线粒体DNA缺少组蛋白的保护，使其容易受到氧化应激、炎症等危险因素的损害，造成及线粒体功能障碍[11-12]，TBI后，损伤本身及坏死的脑组织可诱导活性氧族（ROS）及炎症因子的释放增多[13]，使机体进入氧化应激状态从而造成mtDNA损伤。另一方面，ROS在造成DNA损伤的同时，本身亦可以作为第二信使，触发TFAM和NRF的表达，促进线粒体扩增，从而降低功能障碍mtDNA所占比例，代偿能量供应水平的下降[14-15]。当应用井穴放血后，可见大鼠的PGC-1α基因以及下游的TFAM基因表达进一步升高，且mtDNA拷贝数提高，表明井穴放血可能是通过激活PGC及下游通路，促进mtDNA的生物合成，从而增强创伤脑组织的能量供应，改善脑水肿程度，发挥脑保护作用。同时，本实验还发现，对于重度TBI大鼠，单独应用井穴放血疗法时，虽然可一定程度上促进mtDNA拷贝数的增加，但并未改善神经功能损伤症状及脑水肿程度，这可能是由于重型TBI因损伤严重，会同时累及多条通路，多因素综合作用导致脑水肿的发生，而单独应用井穴放血疗法尚不足以展现改善脑水肿的作用，提示在重型TBI时应多种治疗策略共同施治，辅以井穴放血疗法，或许能展现出更好的治疗效果。

综上所述，本实验通过构建TBI大鼠模型，初步探讨井穴放血对脑水肿及线粒体生物合成基因的影响，为解释井穴放血发挥脑保护作用的机制提供基础研究。但TBI的发病是多因素共同造成，其发生发展也涉及其他多条通路及靶基因，这仍有待挖掘。若能进一步探讨井穴放血对其他通路的影响，或许可为TBI的临床治疗乃至开发井穴放血的新用途提供帮助。

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