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基于气味指纹图谱的玛咖品质快速鉴定方法

2018-03-20党艳婷韩晓峰刘士伟赵可心周文萱李爱民段胜林

食品科学 2018年6期
关键词:深色电子鼻传感器

党艳婷,苑 鹏,夏 凯,韩晓峰,刘士伟,赵可心,周文萱,温 霖*,李爱民,段胜林,*

(1.中国食品发酵工业研究院,北京 100015;2.新时代健康产业(集团)有限公司,北京 102206;3.江南大学生物工程学院,糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122)

玛咖(Lepidium meyenii)又称玛卡、马卡、MACA,为十字花科(Brassicaceae)独行菜属(Lepidium)1 a生或2 a生草本植物,原产于秘鲁中部基宁及帕斯科附近3 500 m以上的安第斯山区,为当地常用蔬菜[1-6]。玛咖具有很高的营养价值,具有抗疲劳、增强免疫力、提高生育力、抗炎症、抗癌、抗氧化、抗病毒、降血压、缓解抑郁和治疗女性更年期综合征等多种功效[2,4,6-12]。

自2011年卫生部将玛咖粉列为新资源食品以来,国内玛咖行业发展迅速,产量不断攀升,但是市场上玛咖的质量和价格参差不齐,掺假现象严重,而且国内尚无玛咖及相关产品的行业和国家标准,因此探索一种快速鉴别玛咖品质和等级的方法势在必行,据此可为消费者提供玛咖的品质保障,可有效控制玛咖市场规范化运行,促进玛咖产业的良性发展。

芥子油苷是一种仅在十字花科植物中发现的次生代谢产物[13],为玛咖的主要活性成分之一,其含量的高低是评价玛咖质量优劣的重要指标。玛咖中的芥子油苷主要有苄基芥子油苷和间甲氧基苄基芥子油苷2 种,二者的总含量占玛咖中总芥子油苷含量的90%。目前玛咖中芥子油苷含量测定主要采用高效液相色谱法[14-15]或者液相色谱与质谱联用法[16],虽然能够精确检测芥子油苷的含量,但预处理过程复杂,检测周期长,检测成本高,在玛咖生产加工企业中以及市场检测中难以实现大批量、低成本、快速高效的品质控制。

电子鼻是一种模拟人的嗅觉来分析、识别、检测复杂嗅味和挥发性成分的仪器,主要由气味取样操作器、气体传感器阵列和信号处理系统3 种功能器件组成[17-18]。在传感器阵列中,每个传感器对被测气体都有不同的敏感度,其瞬态响应信息经信号处理系统分析提取后以响应强度值(对应于相对电阻变化率)输出[19]。由于其前处理简单、检测周期短、可以分析整体气味信息等优点,电子鼻在饮料、食品、酒类等的鉴别、分级、质控等方面应用广泛[20-22]。

本研究将在国内外率先通过统计学手段找到芥子油苷含量与电子鼻传感器之间的相关性,建立一种运用气味指纹图谱结合软独立建模分析(soft independent modeling class analogy,SIMCA)快速鉴别玛咖品质和等级的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品均为实地采收的新鲜玛咖块根,分别来自四川省西昌市、云南省大理市、昆明市、丽江市、香格里拉市等地的24 个国内玛咖主要种植区,所检测玛咖品系包含黑色、紫色、黄色3 种,采收日期为2016年4月。样品编号及产地如表1所示。

表1 玛咖编号及产地Table 1 Information about maca samples tested in this study

硫酸酯酶、葡聚糖凝胶(均为分析纯) 美国Sigma公司;醋酸钠、甲醇、醋酸(均为分析纯)北京化工厂。

1.2 仪器与设备

LC-20AT型高效液相色谱仪 日本岛津公司;FOX4000型电子鼻(带18 根MOS传感器配HS-100型自动进样器、AG2301型高纯空气发生器、Alpha Soft12.45版软件) 法国Alpha MOS公司;20 mL顶空瓶 上海安谱实验科技股份有限公司;PL203型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;DQ-103/104型台式方形中药切片机 温岭市林大机械有限公司;DHG-9145A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;BJ-500A型高速多功能粉碎机 德清拜杰电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玛咖粉的制备

样品先去除须根和顶部,用清水冲洗干净,再用去离子水冲洗3 次;切成2 mm的薄片,42 ℃鼓风干燥至含水量为6%~9%,粉碎并过60 目筛,收集样品,用自封袋封存备用。

1.3.2 芥子油苷的提取[17]

称取1.3.1节制备好的粉末200.0 mg至50 mL离心管,加入15 mL 80%甲醇溶液,84 ℃水浴30 min,迅速冷却至0 ℃,4 000 r/min离心10 min;取上清液2 mL缓慢加入已制备好的葡聚糖离子交换柱中,封存30 min待柱子平衡,排干上清液;分2 次加入2 mL 0.02 mol/L醋酸钠溶液,2 次均排干;加入75 μL硫酸酯酶溶液至离子交换微柱,室温反应16 h;分别用0.5 mL去离子水冲洗离子交换柱3 次,收集洗脱液,过0.45 μm滤膜待测,每个样品重复测定3 次。

1.3.3 色谱条件

色谱柱:Waters C18柱(3.9 mm×150 mm,5 μm);流动相:A为水,B为乙腈;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;紫外检测器检测波长229 nm;进样量10 μL。

1.3.4 标准曲线的制作

用苯甲基硫代葡萄糖苷作标准对照品。称取10 mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于5 mL水中,得到20 mg/mL的苯甲基硫代葡萄糖苷标准液,分别吸取上述标准液0.1、0.5、2.5、5 mL,定容至10 mL,制备质量浓度为0.2、1、5、10 mg/mL的标准液,经液相色谱测定,以峰面积为纵坐标(y),以苯甲基硫代葡萄糖苷质量浓度为横坐标(x),作出标准曲线,得线性回归方程y=265 653x-3 216,R2为1,在0~10 mg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系。

1.3.5 电子鼻顶空进样及检测条件

准确称取(1.500±0.001)g制备好的玛咖粉末至20 mL顶空瓶中,每个样品3 个平行,置于样品盘中待测。仪器参数:采集时间120 s;数据采集延迟时间1 080 s;进样量4 000 μL;进样速率1 000 μL/s。自动进样仪参数:孵化器时间120 s;孵化温度50 ℃;注射器温度60 ℃。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件对芥子油苷含量与传感器响应值进行Pearson相关性分析,找到显著相关的传感器;用训练集样品电子鼻气味分析数据建立SIMCA模型,并用测试集样品对建立好的模型进行可行性验证。

2 结果与分析

2.1 玛咖中芥子油苷的高效液相色谱检测结果

图1 苄基芥子油苷高效液相色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of benzyl glucosinolate

如图1所示,各色谱峰之间分离效果良好,无交叉现象,通过查阅文献[23]可知,13.721 min和16.092 min处为2 种玛咖芥子油苷。其中,13.721 min处为苄基芥子油苷,16.092 min处为间甲氧基苄基芥子油苷,本研究中芥子油苷的含量为这2 种苄基芥子油苷之和。

36 个供试品的芥子油苷含量如表1所示。供试玛咖样品中均含有芥子油苷这一特征性活性物质,但是不同样品中含量相差很大,从1.37~14.47 mg/g不等,这可能与玛咖产地、品系、日照时间、海拔、施肥、灌溉以及种植方式等因素有关[23-25]。

2.2 传感器的选择

以芥子油苷含量(x18)为自变量、电子鼻传感器的响应值(x1~x17)为因变量作相关性分析,分析结果如表2所示。通过相关性分析可知,在置信度(双侧)为0.01时,x12(-0.142)和x14(-0.157)与x18(芥子油苷含量)呈极显著的相关性;在置信度(双侧)为0.05时,x1(-0.117)、x5(0.104)、x6(-0.135)、x7(-0.122)、x9(-0.122)、x10(-0.131)、x11(-0.130)、x13(-0.126)、x15(-0.118)、x16(-0.125)、x17(-0.122)与x18(芥子油苷含量)显著相关,经过不同传感器组合实验可知,传感器x6(T30/1)、x12(P30/1)、x14(P30/2)组合效果最佳,因此,选择x6、x12、x14三根传感器数据进行SIMCA。由表3可知,这3根传感器都对有机化合物产生高响应,说明芥子油苷含量高的样品中有机挥发性成分的浓度较低[26]。

表3 3 根传感器性能参数Table 3 Performances of three sensors

2.3 SIMCA鉴定玛咖等级

SIMCA算法是二值鉴定法,首先用训练集样本建立鉴定模型,然后利用建立好的模型对待测样品进行二值鉴定,判断该样品是否属于目标类别[27]。一般只采用“拒绝率”评价SIMCA模型的鉴定效果,拒绝率越高,

表示非目标样品被判为目标样品的概率越小,但是目标样品的鉴别正确率仍然无法保证。因此,本研究结果验证采用拒绝率和接受率相结合的方法,拒绝率和接受率都高才是模型效果好的充分必要条件,公式如下:

表2 芥子油苷含量与传感器响应值相关性分析Table 2 Correlation between glucosinolate content and sensor response values

将供试品中3/4的样品作为训练集,1/4作为测试集,选择传感器x6、x12、x14进行SIMCA,得到2 种模型,如图2所示。

图2 软独立建模鉴定步骤示意图Fig. 2 Schematic diagram showing soft independent modeling analysis

2.3.1 模型I

模型I分为两级:第1级将训练集样品划分成了2 个区域:一等品区和二、三等品区,第2级是将二、三等品区划分为二等品区和三等品区。

2.3.1.1 模型I第1级分析

图3 模型I中第1级SIMCA图Fig. 3 SIMCA of first step in model I

对27 个训练集样品进行SIMCA建模分析。由图3可知,定义芥子油苷含量不小于10 mg/g的样品为目标组时,验证得分为99分,模型有效。芥子油苷含量不小于10 mg/g的样品均处于深色区域内,而芥子油苷含量小于10 mg/g的样品均处于深色区域外。若未知样品映射到深色区域内,表明其芥子油苷含量不小于10 mg/g,为一等品;若未知样品映射到深色区域外,表明芥子油苷含量小于10 mg/g,为二、三等品。

2.3.1.2 模型I第2级分析

图4 模型I第2级SIMCA图Fig. 4 SIMCA of second step in model I

对芥子油苷含量小于10 mg/g的25 个训练集样品进行SIMCA。由图4可知,定义5 mg/g≤芥子油苷含量<10 mg/g的样品为目标组时,验证得分为91分,模型有效。5 mg/g≤芥子油苷含量<10 mg/g的样品均处于深色区域内,而芥子油苷含量小于5 mg/g的样品均处于深色区域外。若未知样品映射到深色区域内,表明其5 mg/g≤芥子油苷含量<10 mg/g,为二等品;若未知样品映射到深色区域外,表明芥子油苷含量小于5 mg/g,为三等品。

2.3.2 模型II

模型II分为两级:第1级将训练集样品划分成了2 个区域:三等品区和一、二等品区,第2级是将一、二等品区划分为一等品区和二等品区。

2.3.2.1 模型II第1级分析

图5 模型II第1级SIMCA判别模型Fig. 5 SIMCA of first step in model II

对27 个训练集样品进行SIMCA。由图5可知,芥子油苷含量小于5 mg/g的样品均处于深色区域内,而芥子油苷含量不小于5 mg/g的样品大部分处于深色区域外,区域边界有交叉(部分一、二等品落到了三等品区),但是基本趋势和模型I相同。若未知样品映射到深色区域内,则不能确定其芥子油苷的含量,无法实现等级评定。

2.3.2.2 模型II第2级分析

由图6可知,定义芥子油苷含量不小于10 mg/g的样品为目标组时,验证得分为97分,模型有效。芥子油苷含量不小于10 mg/g的样品均处于深色区域内,而5 mg/g≤芥子油苷含量<10 mg/g的样品均处于深色区域外。若未知样品映射到深色区域外,表明5 mg/g≤芥子油苷含量<10 mg/g,为二等品;若未知样品映射到深色区域内,芥子油苷含量不小于10 mg/g,为一等品。

图6 模型II第2级SIMCA图Fig. 6 SIMCA of second step in model II

2.3.3 2 种模型的比较

模型I和模型II都分为2 级,都把样品分成了3 个等级,鉴定原理相同。但是两者分组方式不同,鉴定顺序也不同;模型I中第1级将所有样品划分成了2 个区域:一等品区和二、三等品区,第二级是对第1级中二、三等品区的放大;模型II中第1级将所有样品划分成了2 个区域:三等品区和一、二等品区,第2级是对第1级中一、二等品区的放大。本研究一等品中芥子油苷的最低含量为11.89 mg/g,与二等品中芥子油苷的最高含量9.37 mg/g相差2.52 mg/g,而二等品最低含量(5.33 mg/g)和三等品最高含量(4.61 mg/g)相差仅为0.72 mg/g,因此在SIMCA一级图中一等品与二、三等品之间距离较远,有明显界限,而二等品和三等品距离很近,界限不明显,边界处略有交叉,模型I中第2级对二、三等品区域进行了放大,拉大了样品之间的距离,从而使“微小差异扩大化”,因此使用模型I作为玛咖品质等级快速鉴定的效果更好。综上所述,本研究选择模型I作为鉴定模型。

2.4 结果验证

将部分随机样品作为测试集,将测试样品的电子鼻测试的气味指纹图谱数据映射到模型I中,验证其正确性。

2.4.1 第1级验证结果

图7 第1级鉴定模型验证Fig. 7 Validation of the first-step identification model

如图7所示,未知样品(即测试集样品)的验证结果。YXWPM-2P映射到了一等品区,一等品接受率为100%;YXJS-1B、YDHCC-3P、YLYSR-3Y、YLNXP-3Y、YDJJB-1B、YXWBH-3Y、YDHCH-5Y、YKLMA-2P均映射到了二、三等品区,一等品拒绝率为100%,表明该模型有效。

2.4.2 第2级验证结果

图8 第2级鉴定模型验证Fig. 8 Validation of the second-step identification model

如图8所示,为未知样品(即测试集样品)的验证结果。YLYSR-3Y映射到了二等品区,二等品接受率为100%,三等品拒绝率为100%;YLNXP-3Y、YDJJB-1B、YXWBH-3Y、YDHCH-5Y、YKLMA-2P均映射到了三等品区,二等品拒绝率为100%,三等品接受率为100%,表明该模型有效。

2.5 电子鼻气味指纹图谱

图9 3 个等级玛咖响应信号雷达图Fig. 9 Radar chart for response signals of three grades of maca

由图9可知,一等品、二等品、三等品从原点向外依次分布,进一步表明芥子油苷含量和多数传感器响应值之间存在显著的相关性。

3 讨 论

电子鼻是一种仿生学智能感官分析仪器,通过传感器阵列对试样顶空气体的感应情况来获得其整体气味信息,亦称“气味指纹图谱”[28]。气味是试样内部组成成分的一种感官表征,在检测条件相同的情况下,试样中某一类挥发性物质含量高,那么对这一类物质敏感的传感器响应值就高,也就是说气味与物质的挥发性成分之间具有一定的关联性。汪萌等[29]研究了高效液相色谱法和电子鼻仿生技术在三七等级评价中的应用,结果表明,气味识别能将云南春七各等级进行区分并归类,提示三七气味与等级具有相关性。本实验根据这一理论基础对玛咖中芥子油苷的含量和电子鼻传感器的响应值之间的相关性进行了研究,结果表明,芥子油苷含量与电子鼻T30/1、P30/1、P30/2三根传感器之间具有显著的相关性。

本实验结合传统的芥子油苷含量测定方法,探索玛咖气味与芥子油苷含量之间的内在联系,建立了一种采用电子鼻气味指纹图谱快速鉴定玛咖品质和等级的方法。该法无需繁琐的提取处理,操作简单易行,检测周期短,成本低,可以用于企业原料控制和市场质量检测,也可以为其他样品的质量评价和等级鉴定提供参考。此外,本研究中3 个等级芥子油苷含量的范围可以为玛咖标准制定提供依据。芥子油苷在产后贮藏和加工过程中会被黑芥子酶分解成异硫氰酸等刺激性气味物质[30],加工处理方式越复杂,程序越多,越不利于芥子油苷的保留,因此,该方法能够更好地检测到芥子油苷的真实值。但是值得注意的是,粉碎会导致细胞破裂,从而使芥子油苷和黑芥子酶直接接触,也会造成芥子油苷的少量损失。若要准确测定芥子油苷的含量,还需对芥子油苷、玛咖酰胺、玛咖烯等生物活性成分之间的转化机制进行深入研究。该方法的优势是能够无损快速地确定玛咖中芥子油苷的含量区间,进而鉴定其品质。

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