严瑞红 卢宏柱

1长江大学第一临床医学院儿科（湖北荆州434000）；2公安县人民医院儿科（湖北荆州434300）

微小病变病（MCD）是特发性肾病综合征之一。临床上以大量蛋白尿，低蛋白血症，高脂血症，水肿为主要特征［1⁃2］。病理上表现为电镜下可见足细胞足突融合或消失，而没有其他结构上的改变，也没有免疫复合物的沉积。血浆蛋白，尤其是白蛋白，怎样通过肾小球滤过屏障从尿中排出至今仍不十分清楚。近年来，各国研究者对MCD蛋白尿产生的机制进行了大量的研究，本文对此进行综述。

1 肾小球滤过屏障负电荷减少

1.1内皮细胞表面负电荷分子因为内皮细胞穿孔的大小的原因，常不被看作是阻止蛋白转送到Bowman氏囊的主要原因。直到后来发现内皮细胞表面覆盖的足细胞标记蛋白（podocalyxin），一种负电荷蛋白，可以减少穿孔的直径，推测可能使白蛋白通过内皮细胞运动受阻，但目前还没有实验研究来证实这一假说。

1.2肾小球基底膜（GBM）负电荷减少GBM是负电荷存在的主要场所之一。在MCD发展中，GBM的低密度层的负离子场所减少［3］，硫酸类肝素/尿肌酐比值增加［4］。临床研究还发现用低分子肝素治疗小儿原发性肾病综合征有利于减少蛋白尿，其机制可能是弹性蛋白酶减少了GBM上的葡糖氨基葡聚糖，使GBM上负电荷减少，低分子肝素通过抑制弹性蛋白酶而起作用［5］。因此GBM上的负电荷减少是MCD的原因之一。GOLDBERG等［6］敲除agrin和perlecan基因，使蛋白聚糖缺乏，GBM的负电荷显著减少，但小鼠不发生蛋白尿，清除分数也无变化。作者认为硫酸类肝素蛋白聚糖可能只有部分表型改变，但不发生MCD。在相似的研究中CHEN等［7］敲除Extl基因，小鼠足细胞表达此基因，足细胞分泌的糖蛋白核心蛋白多聚体受阻，小鼠表现为足突融合，免疫组化分析显示硫酸类肝素糖蛋白下降，尽管足突融合以及硫酸类肝素的丟失，基因敲除小鼠只表现出轻微的白蛋白尿。VAN DEN HOVEN等［8］用小鼠过表达肝素酶去评估不同硫酸类肝素区域，用抗硫酸类肝素抗体去评估肾脏内不同区域的硫酸类肝素粘多糖相关的阴离子区，发现在转基因鼠表达呈5倍减少，而肾小球结构和蛋白分泌正常。

1.3导致GBM上负电荷丢失的介质目前发现至少有3种介质在GBM负电荷丢失中起到了关键的作用。这3种分子被认为是GBM负电荷丢失的介质：促血管新生蛋白因子样⁃4（angiopoietin⁃4，angptl⁃4），IL⁃8 以及血液结合素（hemopexin，Hx）。

人类anglptl⁃4是分子量在45～65 kD的糖蛋白，被认为是MCD产生蛋白尿的一种介质，在MCD患者的血浆、尿和肾小球中均发现Angptl⁃4寡聚体220 kD，PI＜ 8，在4个MCD患者中检出，其中一个人尿中也存在，分子量55～70 kD，PI＞ 8。同样，angptl⁃4寡聚体100～600 kD，PI＜ 8和angptl⁃4分子Pl＞8，在部分MCD患者血中检测出。血清angptl⁃4水平在MCD、FSGS 和膜性肾病活动期增高［9］。肾组织免疫荧光显示弱染色，它位于足细胞、GBM和内皮细胞。Angptl⁃4在MCD中的可能机制包括足细胞分泌angptl⁃4（大多数Pl＞8）转移到GBM和内皮细胞，导致GBM负电荷减少，而出现蛋白尿［10］。在另一组MCD患者中，尿中angptl⁃4与尿蛋白呈正相关，在MCD复发组较对照组尿中angptl⁃4增高。这可能是结果而不是肾小球滤过屏障渗漏的原因。的确，尿中angptl⁃4的水平在其他类型肾小球疾病也增高，如局灶节段性肾小球硬化（FSGS）、膜性肾病等。而且，血清angptl⁃4水平在MCD的复发期较缓解期及对照组下降，另外，与以前的研究比，MCD复发的肾组织中angptl⁃4免疫荧光阴性或很弱。最重要的是在人类足细胞培养中加入MCD患者血清，包括复发期和缓解期，足细胞表达angptl⁃4不增加。最近还没有发现尿中阳离子型angptl⁃4（PI＞ 8）。在MCD复发期，发现了PI5.4的angptl⁃4，因此，挑战了这一学说。一个高PI的angptl⁃4是MCD蛋白尿的介质。总之，angptl⁃4在MCD中的临床意义还有待进一步确定。

血清IL⁃8在MCD复发期较缓解期和对照组增高。给大鼠注射IL⁃8血清水平达到MCD患者相似的浓度，表现出轻度的蛋白尿，用抗IL⁃8中和抗体可预防蛋白尿，提示IL⁃8与蛋白尿之间存在因果关系［11］。另外，给大鼠注入IL⁃8可增加GBM氨基葡聚糖的分解代谢。这些资料提示循环的IL⁃8在产生蛋白尿的某些作用是通过降低硫酸类肝素蛋白聚糖的合成，从而减少GBM的阴离子电荷，最后导致蛋白尿［12］。

Hx是肝脏合成的一种蛋白质，其受体在肝细胞、神经元和巨噬细胞中均有表达，但至今未发现其受体在肾脏表达。但Hx可以改变肾脏裂孔膜蛋白的信号转导及neph⁃rin，podocin，CD2AP蛋白的移位，在各种感染和炎症急性期均增高，血浆纯化和重组的Hx有丝氨酸酶活性，循环的Hx是无活性的，活化的Hx对肾小球滤过屏障有重要的作用，Hx可以使唾液酸糖蛋白和阴离子减少，大鼠实验发现Hx可以使足细胞足突消失，并出现可逆的蛋白尿［12⁃13］，从正常人血浆中分离出来一个片段，称为100 KF片段，分子量为80～100 kD。把它注射到小鼠，15 min后GBM低密度区负电荷减少，尿蛋白分泌增加［14］。笔者认为这一作用是Hx所致。然而，Hx作为MCD的致病因素还缺乏直接证据。

2 足细胞在MCD中的作用

2.1足细胞骨架与裂孔膜的变化MCD是一种足细胞病，肾小球对血浆蛋白通透性的增加是因为足细胞骨架的改变使裂孔膜渗漏，导致蛋白尿。裂孔膜蛋白在维持足细胞骨架稳定中起到了重要作用。足细胞损伤与白蛋白排泄有着密切的联系［15］。动物实验表明，敲除podocin基因NPHS2，可以导致蛋白尿，在少量蛋白尿时，电镜观察足细胞足突正常，当大量蛋白尿时，出现足突融合或消失［16］。

2.1.1Nephrin在维持足细胞骨架中的作用Nephrin是较早发现的裂孔膜蛋白之一，在维持裂孔膜稳定性中起到重要作用，nephrin丢失多的患者，疗效及远期预后不佳［17］，在众多的研究中也发现MCD患者足细胞nephrin表达下降，目前只能认为部分MCD可能与nephrin表达下降有关。

Nephrin蛋白的磷酸化是维持足细胞结构与功能的重要因素，是SD与细胞骨架信号转导中的关键调节因子［18］。但用不同方法研究nephrin在MCD中的作用得出了矛盾的结果。一些研究表明肾小球nephrin表达在MCD与正常对照组中无差别。也有证据显示nephrin mRNA表达下降。这些相互矛盾的结果部分解释原因可能是使用的研究方法的不同。因此，只能认为MCD nephrin表达下降没有确切的依据。

Nephrin有调节肌动蛋白聚合的作用。Nephrin磷酸化下降导致蛋白尿，在MCD患者中，nephrin磷酸化py228比正常肾小球下降。与这一研究相同的，在py1217位neph⁃rin磷酸化在MCD患者肾小球中的表达在蛋白尿期比缓解期下降。把足细胞与MCD复发的患者血清培养和与缓解期血清培养，结果发现前者nephrin磷酸化下降。从形态学上发现肌动蛋白重组也发生改变，基于这些发现，推测足细胞骨架改变破坏了SD的正常形态，导致SD通透性增高，从而出现蛋白尿［19］。Nephrin磷酸化是MCD损伤的机制仍不十分清楚。目前发现3种蛋白可能对nephrin磷酸化过程起到干扰作用，它们分别是CD80、c⁃mip和SHP⁃1。

CD80（也称B7⁃1）是足细胞表达的一种跨膜蛋白，足细胞CD80与蛋白尿之间的联系基于一个实验。注射LPS小鼠足细胞表达CD80增加，足突消失，并出现蛋白尿，相比之下，CD80敲除小鼠注射LPS没有发现这种现象。内皮素⁃1 A型受体拮抗剂有抗蛋白尿的作用，这一作用是通过抑制足细胞表达CD80而实现［20］。在MCD患者尿中CD80增高，外周血单个核细胞CD80 mRNA表达增高，而其他肾小球疾病（FSGS、LN）尿中CD80不增高［10，21］。尿中CD80的来源是足细胞，理由是：首先、S⁃CD80低血清水平（可溶性CD80的分子量是23 kD）复发的MCD患者较正常对照组下降［21］。其次、尿中CD80分子是53 kD，与整个细胞膜相关的CD80一致，与循环的可溶性CD80相反，循环的CD80是B细胞产生的。尿中的CD80与MCD也有密切的关系，并且可以作为判断MCD对激素治疗反应的指标之一［22］。最近研究［10］发现，CD80在7个MCD患者复发期的肾小球中全部存在，但在2个FSGS患者中微量或不存在，在一个MCD患者缓解期也缺失，所有复发期的7个MCD患者小管上皮细胞染色没有CD80。另一项研究还发现人的足细胞与MCD复发患者血清培养CD80表达增加，并伴随着nephrin磷酸化减少，而用缓解期患者血清培养没有这种现象，因此可以认为，CD80可能干扰nephrin磷酸化和抑制Fyn和（或）Nck蛋白。动物实验还发现TNF⁃α，polyI：C、LPS和IL⁃13也刺激足细胞表达CD80，过表达的CD80和Neph1通过细胞外域相互作用，导致裂孔膜破坏［23］。这些结果都支持一个假说，一种循环因子介导蛋白尿。

C⁃mip是一个86 kD蛋白，Balb/c和SCID小鼠暴露于LPS可以导致蛋白尿和足细胞c⁃mip过表达，用c⁃mip siR⁃NA预处理小鼠再注射LPS，明显的降低蛋白尿，提示在c⁃mip和蛋白尿之间有一定的联系。足细胞c⁃mip转基因小鼠足细胞足突消失，大量蛋白尿伴有nephrin磷酸化减少，以及活化的Fyn。用重组的IL⁃17与小鼠足细胞培养，可导致足细胞凋亡和细胞骨架紊乱，这一作用是IL⁃17使C⁃mip过表达，从而下调磷酸化nephrin和Bcl⁃2水平而起作用［24］。用免疫组化和原位杂交技术在MCD复发期肾小球c⁃mip较恢复期增高。在Reed⁃Sternberg细胞和Hodgkins淋巴瘤发展为MCD的患者c⁃mip选择性表达，而在Hodgkins患者没发生蛋白尿时c⁃mip不表达。最近对1例小细胞型肺癌患者并发肾病综合征的研究发现，c⁃mip在足细胞和肺癌细胞中过表达，把患者血清与人足细胞培养，发现足细胞骨架紊乱，并且诱导c⁃mip表达，说明c⁃mip在小细胞型肺癌相关的足细胞病中起到重要的作用［24］。体外实验及动物研究表明足细胞c⁃mip与Fyn结合阻止他与nephrin作用，导致nephrin磷酸化减少，从而改变下游的连接SD和细胞骨架蛋白信号级联反应［25］。C⁃mip在MCD的临床关联性还不清楚，因为（1）Fyn缺陷小鼠表现出蛋白尿上调足细胞c⁃mip、使人想到c⁃mip是Fyn失调的结果，而不是原因；（2）把人的足细胞与MCD患者复发期血清培养和与缓解期血清培养，Fyn表达无变化，这一发现与假说机制MCD患者c⁃mip抑制Fyn相矛盾，c⁃mip可能反映出足细胞对noxa的非特异性效应。

SHP⁃1属于PTPs家族，在蛋白酪氨酸激酶如Fyn和PTPs之间的紧密调节，是维持靶蛋白，如nephrin磷酸化稳定水平必须的，反过来调节下游信号通路。在高糖下培养人足细胞过表达SHP⁃1导致nephrin磷酸化选择性位点在Tyr1193和Tyr1217残基，SHP⁃1抑制防止nephrin磷酸化提示在SHP⁃1和nephrin之间有联系［26］。

2.1.2半乳糖凝集素1半乳糖凝集素1（Galectin⁃1，Gal⁃1）是一个135个氨基酸组成的蛋白，基因为LSGALS1。是细胞运动、黏附和免疫修饰剂。在人类肾小球内皮细胞和系膜细胞表达，另外，它与nephrin胞外域共存，人类足细胞与重组的Gal⁃1培养，表现出nephrin磷酸化增加，提示Gal⁃1在SD中起到了一个信号介导作用，在MCD复发患者的研究中发现肾小球Gal⁃1表达下降。最近，OSTALSKA等［27］发现在MCD和对照组中均无Gal⁃1表达，而在FSGS和弥漫性系膜增生患者足细胞中检测出。

2.1.3血液结合素体外实验表明Hx通过减少nephrin依赖的细胞骨架改变介导蛋白尿。细胞骨架改变是Hx色氨酸蛋白酶活化的结果，因为当足细胞暴露在Hx低剂量蛋白酶抑制剂AEBSF减少肌动蛋白纤维的重排，这一发现的意义仍不清楚，因为蛋白酶抑制剂SPI具有肌动蛋白重排的独立作用，用10%正常人血浆预处理，可以完全阻断Hx对肌动蛋白重排作用。

2.2F⁃actin与SD蛋白的相互作用Synaptopodin免疫组化研究MCD患者显示较对照组减弱。但另个研究发现无差异。HORIONUCHI等［28］发现儿童肾病综合征MCDpodo⁃cin降低，包括激素耐药型肾病综合征。可能与NPHS2突变有关。相反，另一个研究6例MCD用免疫组化的方法，与对照组没差别［28］。

2.3足细胞与GBM之间的黏附蛋白α⁃dystroglycane（α⁃DG）和唾液酸苷酶在MCD和4个正常肾小球中的表达，以及尿中唾液酸两组无差别。在MCD中，α⁃DG的表达较正常降低25%～50%因为α⁃DG免疫金标更强，前者得到的值更确切地反应其病理生理特点。更有趣的是经激素治疗的MCD患者α⁃DG的表达明显恢复，然而，低表达α⁃DG的现象不能得出是因为低浓度α⁃DG而导致的蛋白尿。最近在小鼠发现无α⁃DG肾小球足细胞足突变平但没有蛋白尿。

整合素：BARADI等［29］研究整合素家族亚单位用荧光免疫方法，6个正常肾组织和10个MCD、膜性肾病和狼疮性肾炎，在正常肾小球人a3为主要的整合素荧光呈线性沿GBM分布，在MCD和狼疮性肾炎a3染色正常。LAH⁃DENKARI等［30］发现MCD和芬兰型先天性肾病综合征伴大量蛋白尿者足细胞与GBM也紧密结合。

3 调节性T细胞（Tregs）与MCD机制之间的关联

Tregs是一种动态的细胞群体：在平衡状态下，它们的水平较低。几乎所有蛋白尿模型都证实了低Tregs和蛋白尿之间有着密切联系［31］，低Tregs和蛋白尿之间的关系取决于观察的时间点，动物试验表明：（1）阿霉素肾病可以通过输注Foxp3转导的T细胞或通过输注腺苷或通过使用低剂量IL⁃2来调节；在所有这些病例中，循环Tregs上调，蛋白尿下调［32］；（2）将Tregs直接输入Buffalo/Mna大鼠与蛋白尿减少和肾脏病变消退有关；（3）在LPS肾病中也研究了Tregs的作用，它代表了瞬时蛋白尿的模型；在这种情况下，通过使用IL⁃2/抗IL⁃2免疫复合物调节Tregs水平，诱导CD4+细胞分化成 Tregs［33］。输注IL⁃2/抗 IL⁃2可以减少阿霉素肾病大鼠的蛋白尿，改善肾功能。也有相关实验在用LPS处理的小鼠中，使用相同的方法使得蛋白尿的减少。在用他克莫司治疗SRNS的过程中，发现病理类型为MCD患儿，其临床症状完全缓解率要低于MsPGN和FSGS；反而其复发率要高于MsPGN和FSGS［34］。利妥昔单抗与SMP⁃DL⁃3b的相互作用可诱导的足细胞肌动蛋白重塑，从而恢复了足细胞的结构和功能［35］。已有很多实验证明Th17与肾脏疾病的发生有着莫大的联系，在观察到低剂量重组IL2是安全的并且可以在人类中使用后，Treg水平的调节已成为MCD的一种新的潜在治疗方法。但目前关于Tregs在人MCD中的作用的证据很少，还需进一步研究。

4 结论与展望

MCD蛋白尿的产生是复杂的，内皮细胞及GBM层负电荷的减少可能是原因之一，但目前没有足够的证据证明这一点。目前更多的学者认为MCD是一种足细胞病，足细胞nephrin，CD80等蛋白的表达异常在蛋白尿的产生中可能起到了激发作用，动物实验发现Treg水平也与蛋白尿的产生密切相关，但是导致蛋白尿的确切机制仍不清楚。今后对MCD的研究重点是找出特异性的异常点，以便针对靶点进行特异性的治疗，从而取代全身免疫抑制的治疗方法。