间充质干细胞的旁分泌作用在组织损伤修复中的研究进展

2018-03-20李小丽王炎朱钟慧田琳

实用医学杂志 2018年22期

李小丽王炎朱钟慧田琳

1首都医科大学附属北京友谊医院、北京热带医学研究所寄生虫病研究室、热带病防治研究北京市重点实验室（北京100050）；2首都医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系、首都医科大学环境毒理学北京市重点实验室（北京100069）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种非造血干细胞的成体干细胞，具有自我更新、多向分化的能力，同时还展现出抑制恶性细胞增殖、免疫调节及抗炎的特性［1］。随着研究的深入，学者们逐渐认识到MSCs的旁分泌效应在组织损伤中起到积极作用。MSCs通过分泌一些可溶性生物活性因子，抑制细胞凋亡和纤维化、促进血管再生、刺激组织内祖细胞有丝分裂和（或）分化以及调节免疫反应促进损伤组织的修复再生［2］。目前MSCs已在骨组织、心肌、肾脏、肺脏、脑组织及肝脏的损伤（如毒性药物、缺血再灌注损伤）中广泛应用［3-4］。MSCs还具有种子细胞的特性，如容易获取、能够快速、大量扩增、无或具有低免疫原性及具有较高纯度，所以在组织工程与再生医学研究中发挥着重要作用。因此，本文就近年来MSCs的旁分泌功能在组织损伤修复中的作用及其机制研究进展作一综述。

1 免疫调节作用

MSCs对固有免疫和适应性免疫均有很强的调节作用。

1.1 固有免疫

1.1.1 巨噬细胞巨噬细胞按照功能的不同可分为M1型和M2型，M1型巨噬细胞以分泌促炎因子为主，发挥促炎功能，导致机体组织的炎症损伤［5］。其分泌的炎性因子一氧化氮、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF⁃α）、白细胞介素-6（interleukin⁃6，IL⁃6）等，均具有很强的抗原呈递作用。但是在MSCs的作用下，这些反应均可被抑制。M2型巨噬细胞可抑制炎症反应，发挥修复组织的功能，以上功能可被MSCs促进。所以MSCs通过对M1/M2型巨噬细胞的调节，抑制炎症反应，促进组织的修复。

靳丽媛等［6］报道MSCs的上清液可以促进巨噬细胞向M2型分化，同时使炎症因子的分泌减少，抗炎因子的分泌增多。在哮喘研究中，人骨髓来源的MSCs可以促进肺泡巨噬细胞向M2型分化，但并不会增加巨噬细胞的总量，从而有效抑制气道高反应性及嗜酸性粒细胞的大量沉积［7］。在横纹肌溶解引起的急性肾损伤中，MSCs促使M2型的巨噬细胞在损伤肾组织中聚集，从而起到抗炎作用，保护肾功能的继续损害及肾小管的损伤。将MSCs与巨噬细胞RAW264.7细胞共培养，发现促炎因子TNF⁃α、IL⁃6含量降低，抗炎因子IL⁃10的含量增加，同时M2型巨噬细胞标志物CD206表达增加，说明MSCs促使巨噬细胞向M2型分化［8］。研究还发现MSCs对巨噬细胞的调节作用是通过旁分泌因子前列腺素E2（prostaglandin⁃E2，PGE2）来实现的。1，25-二羟基维生素D3可以促使MSCs分泌更多的PGE2和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），减少炎性因子的产生，从而调节巨噬细胞引起的炎症反应［9］。

1.1.2 中性粒细胞在免疫复合物引起的血管炎研究中，MSCs可以抑制中性粒细胞的呼吸爆发，降低细胞死亡及过氧化物酶的释放，从而减少组织损伤。给予不同数量的MSCs，中性粒细胞的氧化还原反应被抑制，MSCs的数量越多，其抑制作用越显著。MSCs还可抑制中性粒细胞死亡的数量，其释放的各种酶如髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP⁃9）及中性粒细胞弹性蛋白酶的释放也被抑制。其抑制机制为MSCs分泌的细胞间黏附分子-1下调了中性粒细胞的吞噬作用及胞外过氧化物歧化酶3的释放，减轻了氧化应激的水平，从而抑制中性粒细胞的死亡及蛋白酶的释放［10］。急性肺损伤时，大量中性粒细胞迅速进入肺实质，释放氧自由基、蛋白溶解酶及炎症介质，加重炎症反应［11］。MSCs可抑制以上物质的释放，减轻肺组织的炎症反应及氧化性损伤，提高动物的存活率［12］。

1.1.3 树突状细胞（dendritic cells，DC）MSCs可以通过旁分泌肿瘤坏死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor⁃inducible gene 6，TSG⁃6）抑制DC的成熟及功能［13］。成熟的DC 高表达抗原 CD80、CD86、MHC⁃II及 CD11c，未成熟的DC均低表达这些抗原。当成熟的DC加入MSCs后，其表面的上述抗原表达降低，说明MSCs可以抑制DC的成熟。将MSCs的TSG⁃6基因沉默之后，再与DC共培养，发现DC的成熟度未被抑制，说明MSCs确实通过TSG⁃6抑制DC的成熟。另一方面MSCs还可以抑制DC的功能。成熟的DC分泌IL⁃2，DC越成熟，分泌的IL⁃12越多。IL⁃12可激活T淋巴细胞，促进其增殖，同时提高干扰素（interferon⁃γ，IFN⁃γ）的水平。MSCs可抑制DC分泌IL⁃12，降低T细胞的增值及IFN⁃γ的水平。但是加入了TSG⁃6基因沉默的MSCs后，DC被抑制的功能均可得到恢复，由此证明MSCs通过旁分泌TSG⁃6抑制DC的功能。所以，MSCs可以通过旁分泌细胞因子抑制DC的成熟及功能，调节免疫反应。

1.1.4自然杀伤（natural killer，NK）细胞MSCs可以抑制NK细胞的功能改变其细胞表型，同时也可以抑制NK细胞的增殖、细胞毒性以及NK细胞所分泌细胞因子的释放，如IFN⁃γ、TNF⁃α、IL⁃10、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及其他调节炎症反应的趋化因子。在败血症模型小鼠体内，MSCs能刺激肺组织中IL⁃10的表达升高，抑制IL⁃6、IFN⁃γ及TNF⁃α等促炎因子的表达。其具体机制为MSCs通过激活JAK/STAT信号通路，上调细胞因子信号转导抑制因子3的目的基因，抑制NK细胞的功能及增殖［14］，从而减轻败血症的炎症反应。

1.2 适应性免疫

1.2.1T淋巴细胞众多肺组织损伤的研究报道中，MSCs有调节T淋巴细胞的作用，其中包括过敏性气道炎症及急性肺损伤。而MSCs调节T细胞的作用表现为不同的作用机制，如MSCs具有抑制T淋巴细胞增殖的作用［15］，其旁分泌的转化生长因子-β及肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是MSCs抑制T淋巴细胞增殖的主要调节因子。也有报道称MSCs旁分泌的PGE2参与了对T淋巴细胞的抑制作用。MSCs还可以抑制T淋巴细胞分泌相应的细胞因子。程序性死亡受体1（programmed death⁃1，PD⁃1）是一种重要的免疫抑制分子，广泛分布于各种组织中。PD⁃1与其配体PD⁃L1结合后可以抑制T淋巴细胞的增殖及其细胞因子的产生。自身免疫性肝炎的研究中，MSCs可以降低血清中转氨酶的水平，减轻肝脏组织的病理损害。其作用机制与抑制Th17所分泌IL⁃17的产生，上调PD⁃1的表达有关。小鼠的自身免疫性肝炎模型经尾静脉注射MSCs，无论是Western blot还是real⁃time PCR检测，PD⁃1的表达明显升高，促炎因子IL⁃17表达下降，说明MSCs通过上调了PD⁃1，抑制T细胞分泌IL⁃17，改善肝脏的免疫反应［16］。所以在T淋巴细胞介导的细胞免疫中，MSCs可通过旁分泌途径调节T淋巴细胞的功能。

1.2.2B淋巴细胞MSCs能抑制B淋巴细胞的增殖、分化及抗体的分泌。MSCs使B淋巴细胞滞留于G0/G1期，抑制B淋巴细胞的增殖。MSCs还可以通过PD⁃1/PD⁃L1的调节，抑制B淋巴细胞的激活。但也有文献报道MSCs可促进纯化的小鼠B淋巴细胞的增殖与分化。虽然以上结果完全相反，但ROSADO等［17］的研究给出了合理解释。免疫反应中，MSCs对B淋巴细胞进行免疫调节的同时会伴有T淋巴细胞的参与。MSCs需要CD3+T淋巴细胞的参与，来发挥抑制B淋巴细胞增殖的作用。无论MSCs、T淋巴细胞及B淋巴细胞之间直接接触，还是他们所分泌的可溶性细胞因子，都依赖PD⁃1/PD⁃L1的调节作用。通过PD⁃1/PD⁃L1的调节，MSCs抑制滤泡及边缘区B淋巴细胞的激活。T淋巴细胞释放的细胞因子IFN⁃γ可以激发MSCs与B淋巴细胞之间PD⁃1/PD⁃L1的作用。若MSCs抑制T淋巴细胞释放IFN⁃γ，则PD⁃1/PD⁃L1信号通路被阻止，MSCs则无法发挥抑制B淋巴细胞的作用，B淋巴细胞的增殖及分化功能可以得到恢复。所以MSCs在调节免疫反应的过程中，各种细胞及细胞因子相互关联、相互作用，会得到不同的实验结果。

研究证实MSCs还可以抑制B淋巴细胞分化为浆细胞。通过细胞的直接接触，MSCs可以抑制B淋巴细胞向浆细胞分化［18］。MSCs产生的白介素1受体拮抗剂抑制了B淋巴细胞的成熟分化［19］。

2 抗氧化应激

MSCs有减轻氧化应激的作用。首先MSCs可以增加清除自由基的酶类表达，如NADPH依赖的醌氧化还原酶（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶及血红素氧化酶-1（heme oxygen⁃ase⁃1，HO⁃1）。脂多糖引起的急性肺损伤中，给予 MSCs后，抗氧化酶HO⁃1的表达量明显增高，过氧化指标丙二醛的表达量明显降低，说明MSCs通过提高HO⁃1的表达，减轻脂多糖引起的急性肺损伤［20］。在肾脏的缺血再灌注损伤中，过表达HO⁃1的MSCs可促进肾脏组织损伤修复因子基质细胞衍生因子-1、VEGF及HGF的分泌，肾功能及病理损伤明显好转［21］。

Nrf2是一种调节氧化应激反应的重要转录因子，氧化应激促使Nrf2被激活并进入细胞核，与核内的Mar蛋白结合形成异二聚体后识别并结合抗氧化反应元件，启动ARE调控的多种抗氧化酶及II相解毒酶基因表达或活化，如SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽S转移酶、HO⁃1等，来增加细胞对氧化应激的抗性［22］。在博来霉素诱导的肺纤维化中，博来霉素减少了抗氧化物质基因NQO1、HO⁃1及Nrf2的表达。给予MSCs移植后，可通过增加上述抗氧化物质的表达，激活Nrf2通路，抑制氧化应激反应，阻止胶原蛋白的沉积，减轻肺组织的纤维化程度［23］。

3 血管新生及血管发生

MSCs可修复机体组织的缺血梗死，如心肌梗死、脑缺血缺氧及肾缺血性损伤。MSCs可以促进内皮细胞的增殖、发芽及迁移，形成血管样的结构，它还可以旁分泌血管再生所需的各种细胞因子促血管再生。MSCs能够分泌足够的VEGF促进血管内皮细胞增殖［24］。虽然VEGF对血管形成的调控占主导地位，但血管形成过程复杂，还有其他因子参与。在心肌缺血的大鼠模型体内，注射MSCs条件培养基（MSCs conditioned medium，MSCs⁃CM）可促进心肌梗死边缘毛细血管的形成，缩小心肌梗死的面积，说明MSCs通过旁分泌的方式达到改善心肌功能的作用。基因芯片技术检测提示MSCs分泌的因子多数为促进血管生成的细胞因子，如VEGF、碱性纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、促血小板生成素及血小板源性生长因子-BB［25］。这些促进血管生成的细胞因子参与了组织修复及血管的形成。

除了这些细胞因子，基质金属蛋白（MMPs）在血管生成中也占有很重要的地位。在体外实验中，MSCs⁃CM虽然不含有VEGF，但是依然发现内皮细胞的迁移和毛细血管的形成，说明即使无VEGF存在，MSCs分泌的其他细胞因子也能促进血管的生成，但前提是有高浓度的金属蛋白酶及MMP⁃2的存在［26］。血管损伤后发生的血管重构包括血管平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡和细胞外基质的改变，这些变化部分由MMPs介导。在三维空间培养MSCs时，MSCs对内皮毛细血管样结构的形成发挥关键作用，但加入MMPs抑制剂后，内皮血管发芽则停止，说明MSCs在调节血管生成的过程中，需要有MMPs的参与［27］。

MSCs通过多种途径改善组织供血状况，目前认为其旁分泌促血管生成因子是其重要机制。

4 外泌体

外泌体也称细胞外囊泡，是直径大约40～100 nm的囊泡，由多种细胞内膜以出芽方式形成的多泡体，释放到细胞间隙，参与细胞间的信息交流，并参与多种生理病理过程［28］。现已证实除了MSCs，还可以分泌外泌体的细胞包括：肥大细胞、淋巴细胞、DC及肿瘤细胞［29-31］等。外泌体在细胞间传递的物质包括：蛋白、脂质、mRNA及多种生物活性成分。

MSCs的外泌体作为细胞间信号传递的介质，其修复潜能己经在各种疾病模型中得到证实。在肺动脉高压大鼠模型中，MSCs源性外泌体能有效降低平均肺动脉压及右心室压，改善肺血管与右心室重构，抑制肺部炎性细胞浸润，减轻组织纤维化［32］。在心肌缺血/再灌注模型中，外泌体可以减少心肌梗死的面积，改善再灌注的损伤［33］。外泌体对肾损伤也有保护作用。在2型糖尿病肾病及胰岛素缺陷型糖尿病肾病的小鼠模型中，含有外泌体的MSCs⁃CM可使血清中的肌酐及尿素氮水平明显降低，肾小管间质的炎性因子TNF⁃α的表达降低，肾小管上皮细胞的上皮-间质转化被抑制，肾纤维化的程度得到改善。外泌体还起到肾小管上皮细胞间紧密连接结构的保护作用及抗凋亡作用［34］。在股动脉切除的小鼠体内，给予外泌体可以促进血管再生相关性因子的表达，促进血管内皮细胞的增殖、迁移及血管的形成，改善下肢缺血的症状［35］。外泌体的研究也涉及到了肝脏疾病，在肝脏缺血再灌注损伤的模型中，外泌体使血清转氨酶水平明显降低，减轻了肝细胞损伤程度，对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用［36］。

虽然外泌体的研究在各种疾病中均表现出较好的效果，但是它发挥作用的机制及具体成分仍需进一步去探讨。