赵 涛 刘家骥

(重庆医科大学附属永川医院泌尿外科，重庆 402160)

微小RNA(miR)和老年前列腺癌有密切关系，参与肿瘤细胞的发生发展〔1～3〕。李明等〔1〕研究发现，miR-183在老年前列腺癌中的表达水平显著增高，且其增高水平与Gleason评分呈正相关关系〔4〕。但是关于miR-183在此方面的研究较少。本实验拟分析miR-183在老年前列腺癌中的表达状态及靶基因促红细胞生成素产生肝细胞受体(EPH)A4对细胞迁移和侵袭的生物学作用。

1 材料与方法

1.1材料和试剂 由重庆医科大学附属永川医院提供经手术切除保留的12对老年前列腺癌组织和癌旁组织，切片均经过病理学鉴定。miR-183 mimics、miR-183、抗链球菌溶血素(AS)O、siRNA EPHA4购自上海吉玛技术制药有限公司。兔抗人EPHA4、羊抗兔二抗及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自中美合资博慧斯生物医药科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 将老年前列腺癌细胞系PC3和LNCaP置于RPMI1064培养基及37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行下一步实验。细胞每2～3 d换液或传代1次。在转染前24 h将对数期的细胞PC3和LNCaP接种到合适的孔板，并使其处于正常生长培养状态(37℃、5%CO2)进行转染。同时设立对照组。

1.2.2RNA提取和实时定量PCR(RT-PCR) 按照Trizol中的步骤提取PC3和LNCaP细胞中的总RNA，对RNA OD260和OD280使用紫外分光光度计进行测定，并计算其浓度。用特异的miR-183引物进行miRNA逆转录反应(RT)，同时以U6作为内参；OligodT作为通用引物进行基因EPHA4的RT，同时以β-actin作为内参。RT-PCR反应体系：cDNA 1 μl、引物各1 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，无菌蒸馏水7 μl。反应程序的设置如下：变性(95℃ 3 min)，然后95℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s进行40个循环。

1.2.3细胞迁移和侵袭实验 细胞迁移实验：将转染24 h后的细胞进行消化收集后，重悬于无血清培养基，种到Transwell的底部具有完全培养基小室内(3×104细胞/孔)。24 h后，将上层小室取出并稳固10 min后磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，选用结晶紫最后染色30 min，然后PBS冲洗，将小室内的细胞用棉签擦掉。细胞侵袭实验：将100 μl Matrigel(终浓度为1 mg/ml)加入Transwell上层小室内，以垂直的方式，37℃培养4～5 h使其干成胶状。其他步骤同细胞迁移实验。

1.2.4miR-183基因的生物学预测方法 使用TargegtScan和miRanda网站对miR-183的靶基因进行预测，结合靶基因的选取的原则，将EPHA4作为候选靶基因。

1.2.5绿色荧光蛋白(GFP)荧光报告载体实验 细胞同时转染miR-183 mimics、miR-183 ASO和含有EPHA4 3′UTR、EPHA4 3′UTR mut的荧光报告载体及对照质粒。48 h后，用1倍PBS清洗，然后通过RIPA裂解液将细胞裂解，再来提取其内的蛋白。最后以RFP作为内参用测荧光的仪器测量荧光值。

1.3统计学方法 应用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-183和EPHA4 mRNA在老年前列腺癌和癌旁组织中的表达 miR-183、EPHA4 mRNA在老年前列腺癌组织中的表达(4.72±0.28，3.22±0.18)显著高于癌旁组织(1.00±0.18，1.00±0.10，P<0.01)。

2.2miR-183对老年前列腺癌细胞转移能力的影响 迁移结果显示，转染miR-183 ASO组PC3、LNCaP细胞穿膜数目〔(77.3±8.3)个、(62.4±6.9)个〕显著低于对照组〔(164.5±10.8)个、(141.2±11.5)个〕。侵袭实验结果显示，PC3、LNCaP细胞穿透膜的数目〔(67.3±9.6)个、(55.1±8.3)个〕明显少于对照组〔(157.9±12.7)个、(147.8±11.2)个，均P<0.01〕，见图1。

图1 miR-183在PC3和LNCaP细胞侵袭和迁移中的作用情况(×200)

2.3miR-183基因的生物学方法预测及对其靶基因的验证 图2显示在EPHA4的3′UTR上含有miR-183的结合位点。含EPHA4 3′UTR的荧光报告载体的荧光值通过miR-183过表达后增强，转染 miR-183 ASO后含有EPHA43′UTR的荧光报告载体的荧光值减弱(P<0.01)；而将结合位点突变后，无论是过表达miR-183还是miR-183表达抑制对突变的报告载体的荧光值没有影响，见图3。RT-PCR结果显示在PC3和LNCaP细胞内过表达miR-183、EPHA4 mRNA水平升高，转染miR-183 ASO后，EPHA4 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，见图4。

图2 miR-183和EPHA4的结合位点及EPHA4突变的结合位点

图3 GFP荧光报告载体实验结果

图4 RT-PCR结果

3 讨 论

miRNA是比较保守的、内源性表达的小分子非编码RNA，广泛参与细胞生长、分化、凋亡甚至肿瘤的发生等细胞的生物学过程，在其中发挥了关键作用〔5〕。有研究显示miR-183在老年前列腺癌中的含量升高〔1～3〕。有研究利用组织芯片检测发现，miR-183在老年前列腺癌中是增高的，且发现随着Gleason评分升高，miR-183表达水平也增高，而与在良性前列腺增生症(BPH)的表达水平差异有统计学意义〔4〕。研究发现，microRNAs let-7d，let-7g，miR-98，miR-96和miR-183的表达谱在一定水平上可以作为老年前列腺癌行为改变在生物学上的反应，可用于作为早期检测的标志物〔6〕。本实验结果提示miR-183在一定程度上可以显著抑制老年前列腺癌细胞的转移。

EPHA4是最大的受体酪氨酸激酶家族EPH的成员之一，EPH受体家族参与细胞的生长、增殖、分化、信号传导、代谢及凋亡等一系列的生物变化，同时也参与一些心血管疾病、代谢性疾病及恶性肿瘤的发生和发展，并发挥着极其有价值的生物学功能〔7〕。多项研究表明，EPH受体家族与肿瘤的发生和转移有密切关系〔8～10〕。本实验结果证明了miR-183可能通过靶定EPHA4来对老年前列腺癌癌细胞的转移进行调控。

1李 明，张洪福，曹立宇，等.前列腺癌组织中4种microRNAs的表达及意义〔J〕.安徽医科大学学报，2009；44(4)：443-6.

2Zhang QH，Sun HM，Zheng RZ，etal.Meta-analysis of microRNA-183 family expression in human cancer studies comparing cancer tissues with noncancerous tissues〔J〕.Gene，2013；527(1)：26-32.

3Mihelich BL，Khramtsova EA，Arva N，etal.miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells〔J〕.J Biol Chem，2011；286(52)：44503-11.

4李 明，尹 玉，曹立宇，等.微小RNA在前列腺癌组织中的表达及意义〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2008；17(6)：565-70.

5Griffiths-Jones S，Saini HK，van Dongen S，etal.miRBase：tools for microRNA genomics〔J〕.Nucleic Acids Res，2008;36：D154-8.

6尹 玉，李 明，李 昊，等.6种microRNAs在前列腺癌组织中的表达〔J〕.中华男科学杂志，2010；16(7)：599-605.

7Ueno K，Hirata H，Shahryari V，etal.microRNA-183 is an oncogene targeting Dkk-3 and SMAD4 in prostate cancer〔J〕.Br J Cancer，2013；108(8):1659-67.

8Nagano K，Kanasaki S，Yamashita T，etal.Expression of Eph receptor A10 is correlated with lymph node metastasis and stage progression in breast cancer patients〔J〕.Cancer Med，2013；2(6)：972-7.

9Chukkapalli S，Amessou M，Dilly AK，etal.Role of the EphB2 receptor in autophagy，apoptosis and invasion in human breast cancer cells〔J〕.Exp Cell Res，2014；320(2)：233-46.

10Li RX，Chen ZH，Chen ZK，etal.The role of EPH receptors in cancer-related epithelial-mesenchymal transition〔J〕.Chin J Cancer，2014；33(5)：231-40.