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重组腺病毒p21转染人毛乳头细胞的模型构建

2018-03-20张国强高顺强

中国老年学杂志 2018年4期
关键词:腺病毒滴度批号

张国强 易 娟 赵 璐 程 毅 高顺强

(河北医科大学第四医院皮肤科,河北 石家庄 050011)

人毛乳头细胞(HDPCs)具有一定的毛发诱导能力〔1〕,对毛发生长及周期循环起到至关重要的作用。而体外培养的DPCs呈现凝集性生长是其主要生物学特性之一〔2〕,这可能和细胞衰老有关。p21(又名细胞周期蛋白激酶抑制因子,CDKN1A)是众多衰老相关基因之一〔3〕,参与调节细胞衰老的许多过程。本实验拟以腺病毒rAd5-CDKN1A成功转染DPCs,沉默DPCs中p21基因,确定转染的转染效率及最佳滴度,以进一步研究p21基因对DPCs生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂 HDPCs(货号:2400,批号:9640)购自美国ScienCell公司,间充质干细胞(MSCM)培养基(货号:7501,批号11626)购自美国 ScienCell公司,腺病毒rAd5-CDKN1A-1p2 shRNA(批号:13079)和rAd5-HKshRNA-EGFP(批号:130725-3)购自武汉淅玛生物有限公司,兔抗人p21单克隆抗体(货号:2990-1,批号:YJ102911CS)购自 EPITOMICS公司,总RNA抽提试剂盒(Trizol)购自Solarbio公司,莫洛尼质鼠白血病病毒(M-MLV)反转录试剂盒(批号8213068)及聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(批号8211212)均购自Invitrogen公司。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2倒置荧光显微镜下测定rAd5-CDKN1A对DPCs转染效率 取对数生长期生长状态较好的DPCs,制成单细胞悬液后以每孔1×105个/ml的浓度接种于2个6孔板中,待细胞完全贴壁后,分别用rAd5-CDKN1A病毒液转染DPCs,感染系数(MOI)分别为0、25、50、200、500〔4〕,于48 h后荧光显微镜下每孔分别随机选择3个200倍视野计数呈现绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数,并在明场中计数该视野内细胞总数,计算转染率(转染率=GFP阳性细胞数/明场下该视野内总细胞数)。

1.33-(4,5-二甲基噻噻-2)-2,5二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测不同浓度rAd5-CDKN1A和rAd5-HK下DPCs的增殖效率 取对数生长期生长状态良好的DPCs制成单细胞悬液,以每孔按1×105个/ml的浓度接种于96孔板。代细胞完全贴壁后,按MOI值为0、25、50、100、200、500加入腺病毒,并设置相应MOI值组,其中以完全培养液为空白对照,每组设立6个平行孔,分别于指定时间(24、48、72、96、120、144 h)弃去培养液,用MTT的方法进行检测,计算细胞增殖效率。

1.4RT-PCR方法检测rAd5-CDKN1A和rAd5-HK转染DPCs后p21基因的表达 收集生长良好的DPCs,按MOI=100分别转染rAd5-CDKN1A和rAd5-HK入DPCs,并收集相应细胞提取mRNA,按M-MLV反转录试剂盒和PCR扩增试剂盒说明进行反转录和RT-PCT扩增,其中p21引物由Invitrogen公司合成,引物A:5'-ATTCAGCATTGTGGGAGGAG-3',引物B:5'-TGGACTGTTTTCTCTCGGCT-3',β-actin 引物也由Invitrogen公司合成,引物A:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',引物B:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。于PCR Pχ2Thermal Cycler机子上设置循环程序为95℃,30 s;47℃,30 s;72℃,20 s;35个循环。之后再以1.5%琼脂糖凝胶电泳实验检测p21基因表达,用凝胶成像分析系统分析电泳结果。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0软件进行t检验,χ2检验,单因素方差分析。

2 结 果

2.1rAd5-CDKN1A和rAd5-HK对DPCs的转染效率 DPCs细胞对腺病毒较敏感,随着MOI的增加,染色阳性率也增加。当MOI取值为0、25、50、100、200和500时,转染效率分别为0、(15.2±2.64)%、(44.3±3.95)%、(95.2±1.06)%、(97.5±1.07)%和(98.9±0.67)%。MOI为0、25、50及100组中各组间差异有统计学意义(P<0.05),而MOI为100、200和500组间差异无统计学意义(P>0.05);MOI为0、25、50和100组显示腺病毒的转染效率与病毒浓度呈明显正相关(r=0.967,P<0.01;Y=0.978 1,X-4.126 7),然而随着病毒浓度的进一步增加,即MOI值为100、200和500时,转染效率升高不明显(r=0.382,P>0.05)。此外,于MOI=200和MOI=500组的视野中,可见小部分细胞漂浮,且MOI=500组细胞漂浮较多,见图1。

图1 不同MOI值的重组腺病毒rAd5-CDKN1A shRNA转染DPCs GFP的观察结果(×200)

2.2rAd5-CDKN1A转染DPCs对细胞增殖抑制的影响 随着腺病毒rAd5-CDKN1A浓度增加,各实验组与相同时间点对照组相比,细胞增殖逐渐受到抑制,其中,MOI=200及MOI=500组对DPCs细胞的增殖抑制效果明显;而MOI=100组对DPCs细胞的增殖促进效果显著(P<0.05),MOI=25和MOI=50组对DPCs细胞增殖无明显作用,见图2。

图2 不同MOI值下DPCs的生长曲线

2.3rAd5-CDKN1A转染DPCs对细胞内p21基因mRNA表达的影响 以MOI=100为理想滴度将rAd5-CDKN1A shRNA和rAd5-HK shRNA导入DPCs中,并提取相应RNA进行反转录、RT-PCR扩增及凝胶电泳分析(以正常细胞为基准,将转染rAd5-HK shRNA的细胞作为空载体对照)。发现rAd5-CDKN1AshRNA处理后的DPCs中p21基因条带明显暗于正常细胞和转染rAd5-HK shRNA的细胞,见图3。

1:rAd5-CDKN1A shRNA,2:rAd5-HK shRNA,3:正常细胞图3 正常细胞、转染rAd5-HK shRNA和rAd5-CDKN1A shRNA细胞中P21基因表达

3 讨 论

DPCs位于毛囊基底部,具有毛发诱导能力,可诱导毛囊形成并在毛发生长、周期性循环及再生中发挥主导作用〔5,6〕。此外,体外培养早期DPCs展现出凝集性生长特性,但体外培养高代次DPCs并不展现这一特性,反而出现生长抑制。有学者认为DPCs凝集性生长特性可能与DPCs的生物学功能有关〔7〕。高代次DPCs逐渐丧失凝集性生长特性可能与细胞衰老有关。而细胞衰老是由细胞周期蛋白激酶抑制因子调控,其中,细胞周期蛋白激酶抑制剂p21也是一种抑癌基因,其在预防肿瘤的发展中起到至关重要的作用,并对细胞衰老起到一定的调控作用。

腺病毒主要是通过细胞表面的特异性受体柯萨奇病毒受体进入细胞,不同类型细胞对腺病毒易感性不同,其易感能力取决于细胞表面作用受体数目的多少〔4〕。腺病毒早期基因(E1)缺失的腺病毒载体本身没有复制能力,但当剂量过大或转染时间过长时,腺病毒对感染细胞却有一定的毒性〔4〕。这限制了目的基因表达的时间和水平,因此,在涉及腺病毒转染的体内外实验研究中,确定最佳MOI便是所有实验最重要的前提。腺病毒细胞毒性与MOI感染时间呈明显的对应关系〔4,8〕,尤其是MOI达到500以上时,细胞毒性和目的基因表达下降都有明显的表现,但MOI低于50时,腺病毒对细胞增殖无明显影响〔4,9〕。相关文献指出,异常超表达的p21可引起细胞生长阻滞,且基因沉默p21大都对细胞增殖有促进作用〔10〕。而另一方面,腺病毒本身对细胞有一定的毒副作用,转染过程中,腺病毒的进入对细胞也是一种外源性刺激,可能引起细胞一系列的干扰反应,使细胞停滞,生理特性发生改变如部分细胞漂浮等。因此,在腺病毒滴度不合适时,转染rAd5-CDKN1A对DPCs的作用可能主要是干扰反应,合适滴度的rAd5-CDKN1A才有可能体现出沉默目的基因p21的作用。细胞部分漂浮可能是由于病毒滴度较大,产生的毒素较多,影响细胞生长状态造成。MTT法绘制转染后DPCs的增殖曲线提示rAd5-CDKN1A对DPCs的增殖有促进作用,符合相关文献中p21沉默往往促进细胞增殖的报道〔10〕。基于腺病毒转染的细胞毒副作用及促进细胞增殖两方面考虑,我们选择MOI=100为rAd5-CDKN1A shRNA转染DPCs的理想滴度。既保证较高的转染效率,又不至于因腺病毒本身对细胞毒性作用而干扰实验结果。为将来研究p21对DPCs生物学特性的影响奠定了基础。

1Matsuzaki T,Yoshizato K.Role of hair papilla cells on induction and regeneration processes of hair follicles〔J〕.Wound Repair Regen,1998;6(6):524-30.

2Yamao M,Inamatsu M,Ogawa Y,etal.Contact between dermal papilla cells and dermal sheath cells enhances the ability of DPCs to induce hair growth〔J〕.J Invest Dermatol,2010;130(12):2707-18.

3Gledhill K,Gardner A,Jahoda CA.Isolation and establishment of hair follicle dermal papilla cell cultures〔J〕.Methods Mol Biol,2013;989:285-92.

4徐 波,张松涛,李龙江,等.重组腺病毒p53转染口腔黏膜异常增生的实验研究〔J〕.华西口腔医学杂志,2009;27(2):122-5.

5Ohyama M,Zheng Y,Paus R,etal.The mesenchymal component of hair follicle neogenesis:background,methods and molecular characterization〔J〕.Exp Dermatol,2010;19(2):89-99.

6Millar SE.Molecular mechanisms regulating hair follicle development〔J〕.J Invest Dermatol,2002;118(2):216-25.

7Yamao M,Inamatsu M,Ogawa Y,etal.Contact between dermal papilla cells and dermal sheath cells enhances the ability of DPCs to induce hair growth〔J〕.J Invest Dermatol,2010;130(12):2707-18.

8Frey BM,Hackett NR,Bergelson JM,etal.High-efficiency gene transfer into ex vivo expanded human hematopoietic progenitors and precursor cells by adenovirus vectors〔J〕.J Blood,1998;91(8):2781-92.

9Lou J,Xu F,Merkel K,etal.Gene therapy:adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces mesenchymal progenitor cell proliferation and differentiation in vivo and bone formation in vivo〔J〕.J Orthop Res,1999;17(1):43-50.

10Gartel AL,Radhakrishnan SK.Lost in transcription:p21 repression,mechanisms and consequences〔J〕.Cancer Res,2005;65(10):3980-5.

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