秦莉霞，吴 倩，夏鹏，高丽娟，徐世军＊＊

（1.成都中医药大学药学院 成都 611137；2.成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所 成都 611137）

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种复杂的神经退行性疾病，是老年痴呆最常见的形式，随着社会人口老龄化的加剧，AD发病率随之增加，AD给家庭乃至社会带来的经济负担也将日益加剧。磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（Phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B；PI3K/AKT）信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一，参与细胞增殖、能量代谢、葡萄糖代谢等多种生物学途径[1]。多项研究显示该信号通路参与AD多项病理进程[2]。中医认为AD属于“痴呆”等范畴，其病症以瘀阻脉络、浊毒痹阻为主，基于以上病机，中医临床防治AD以解毒通络、醒神开窍等为主。参芪益智颗粒是王永炎教授治疗AD的临床经验方，前期研究提示对5XFAD小鼠和APP/PS1小鼠有一定的抗痴呆作用[3,4]。但其对Aβ1-42双侧海马注射AD模型大鼠的作用和PI3K/AKT信号通路的影响还未涉及。

1 材料

1.1 药物与试剂

参芪益智颗粒，北京师范大学，批号：20151215；盐酸多奈哌齐片，卫材（中国）药业有限公司，批号：1511048；Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司，批号：CK0500748；Thermo Scientific Gene JET RNA Purification Kit，赛默飞世尔科技公司，批号：K0731；Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，赛默飞世尔科技公司，批号：K1622；SYBR Premix Dimer Eraser TM（Perfect Real Time），宝日医生物技术（北京）有限公司，批号：RR091A；PI3K抗体，abcam，批号：ab151549；AKT抗体，Cell Signaling Technology，批号：#4685。

图1 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD大鼠Morris水迷宫的影响

引物序列如下：

1.2 动物

SPF级，SD大鼠，40只，全雄，体质量220-260 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证：NO：0012338。

1.3 仪器

Exp Trade C0.Ltd Morris水迷宫系统，成都泰盟软件有限公司；BA400Digital数码三目摄像显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；ND2000PCR扩增仪，美国BIO-RAD公司；i Cycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System，美国BIO-RAD公司；Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，美国Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 动物造模及分组

参照文献[5]，制备Aβ1-42（2 μg·uL-1）寡聚体，并造模[6]，假手术组动物双侧海马注射生理盐水，其余步骤相同。造模成功大鼠30只，随机分为模型组（Model），阳性组（安理申组，Aricept，1.17 mg·kg-1），参芪益智颗粒高剂量组（SYG-H，9.8 g·kg-1），参芪益智颗粒中剂量组（SYG-M，4.9 g·kg-1），参芪益智颗粒低剂量组（SYG-L，2.45 g·kg-1），每组6只，另取假手术组动物6只作为空白对照（Control）。各组动物灌胃给予等体积相应药物（10 ml·kg-1），空白组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水。1次/天，连续给予60天。

2.2 学习记忆功能检测

给药55天后，进行Morris水迷宫实验[7]，期间继续给药。定向航行实验连续5天，记录各组动物逃避潜伏期，定向航行实验结束24 h后撤去平台，进行空间探索实验，记录各动物穿越平台目标象限的时间、穿越平台目标象限的次数、穿越平台次数及穿越平台区域次数。

2.3 HE染色

Morris水迷宫检测结束后，处死大鼠。取脑组织，10%甲醛固定，梯度脱水，包埋，切片（5 μm），脱蜡，染色，封片，镜检。

2.4 脑组织PI3KmRNA、AKT mRNA的表达

取海马，加Lysis buffer工作液和Proteinase K工作液，提取总RNA；反转录：42℃ 60 min，70℃ 5 min；PCR反应：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s）40个循环；计算相对于GAPDH mRNA的表达，-△△Ct=（药物组目的基因Ct值-药物组内参基因Ct值）-（空白组目的基因Ct值-空白组内参基因Ct值）。

2.5 脑组织PI3K、AKT蛋白表达

大鼠处死，取脑组织、免疫组化测定PI3K、AKT蛋白含量。测定平均光密度（IA）。

2.6 统计学方法

数据以均数±标准差（xˉ±s±s）表示，Morris水迷宫逃避潜伏期用双因素方差分析，其余符合正太分布数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正态分布的数据采用两个独立样本t检验进行分析。

3 结果

3.1 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD模型大鼠学习记忆功能的影响

图2 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD大鼠海马CA3区病理形态学的影响

图3 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD大鼠海马PI3K/AKT基因表达的影响

由图1可知，随着训练天数的增加，各组动物逃避潜伏期均有不同程度的缩短。与空白组相比，模型组动物逃避潜伏期明显延长（F=80.13；P＜0.001），进入平台象限次数、穿越平台象限百分比明显缩短（P＜0.05）；与模型组相比，参芪益智颗粒各剂量组逃避潜伏期均明显缩短，其中，高剂量组（F=19.35；P＜0.001）；中剂量组（F=29.48；P ＜0.001）；低剂量组（F=24.14；P＜0.001）；进入平台象限次数和穿越平台象限百分比均明显增加（P＜0.05）。

3.2 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD模型大鼠海马组织病理形态学的影响

与空白组相比，模型组海马锥体细胞（Pyramidal cells，PC）数量减少且排列紊乱、神经细胞（nerve cell，NC）出现空泡化、坏死等现象。与模型组相比，参芪益智颗粒各剂量组动物海马锥体细胞排列整齐，神经元数量减少、空泡化、坏死等现象均有所改善（图2）。

3.3 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD模型大鼠海马PI3K、AKT蛋白及基因表达的影响

与空白组比较，模型组PI3K、AKT蛋白及mRNA相对表达显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，参芪益智颗粒各剂量组PI3K、AKT蛋白呈明显激活状态（P＜0.05），mRNA相对表达有增加趋势（P ＞ 0.05）（图3、图4、图5、图6）。

4 讨论

图4 各组大鼠海马PI3K的表达

图5 各组大鼠海马AKT的表达

图6 参芪益智颗粒对Aβ1-42双侧注射AD大鼠脑组织PI3K/AKT蛋白表达的影响

AD在中医属“呆痴”等范畴，脑失所养、肾精亏虚是其主要发病基础，其发病部位虽然主要在脑，五脏六腑功能失调与其发病同样密切相关[8]。早在二十世纪初，王永炎教授就提出“毒损脑络”可作为中医治疗痴呆新的切入点[3]。参芪益智颗粒是王永炎教授长期临床经验的基础上提炼的组方，方由黄芪、黄芩、人参等药配伍组成，共奏益气健脾、安神益智、解毒通络之功效。方中各药有效成分，如黄芩多种有效成分[9]，人参皂苷[10,11]，黄芪多糖[12]，丹参有效成分[13]等，对多种 AD细胞、动物模型病理进程具有不同程度的改善作用。前期实验提示，该方可减少脑内老年斑的沉积、抑制胶质细胞过度活化、减少脑内Aβ1-42的含量，改善5XFAD小鼠学习记忆功能[3]，也可以通过调节外周血清MMP2和VEGF的含量来改善APP/PS1小鼠学习记忆功能、自发性探索运动活性和焦虑行为[8]。PI3K/AKT信号通路是胞内调控细胞增殖、分化的重要的途径之一，可参与调节包括AD在内的多种疾病的发生、发展[14]。多种AD动物模型[15]、细胞模型[16]均显示PI3K/AKT信号通路明显抑制，该信号通路的抑制与脂糖代谢障碍[17,18]、认知功能障碍[19]、等密切相关，而AD病理过程中伴随明显的葡萄糖代谢障碍和认知功能损伤。Aβ的聚集被视为AD发生发展的关键因素[20]，其在脑内的异常聚集，可诱导一系列神经毒性作用从而导致AD的发生[21]，故Aβ1-42诱导的动物、细胞模型被广泛应用于AD研究。报道显示该模型动物可见明显学习记忆障碍[22]，同时PI3K/AKT信号通路呈明显抑制状态[23]，这与本实验结果一致，经参芪益智颗粒干预后，该模型动物学习记忆能力显著改善，PI3K、AKT蛋白水平上明显激活，基因水平上也可见明显趋势，但无统计学差异，这可能是动物样本个体差异，数据偏差过大所致。综上可知，参芪益智颗粒改善Aβ1-42双侧海马注射AD模型大鼠学习记忆功能可能与以下两方面有关：直接改善脑内AD病理变化；激活脑内PI3K/AKT信号通路，延缓AD进程。