武瑞瑞，李贵平，黄 健，李亚男，杨 阳，黄家雄

(云南省农业科学院 热带亚热带经济作物研究所，云南 保山 678000)

咖啡是用经过烘焙的咖啡豆制作出来的饮料，与可可、茶同为流行于世界的主要饮品，在味觉上会呈现出不同程度的甜度、酸度、醇厚度、干净度。喝咖啡时所感受到的酸味主要来自烘焙过程中生产的酸。烘焙豆中的酸主要是咖啡的水溶性绿原酸、奎宁酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、醋酸、甲酸、乳酸、甘醇酸等三十多种有机酸以及无机磷酸。脂肪族酸(包括醋酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、甲酸)浓度高易有尖酸味。脂肪族酸带有大量的氢离子是咖啡酸滋味的主要来源。而酚酸(包括绿原酸与奎宁酸)浓度高，已有苦味[1]。

因绿原酸是咖啡的功能性物质，且绿原酸含量多时会引起咖啡的涩味。近几年来，对咖啡成分含量测定主要集中在功能成分方面，如绿原酸[2-7]、咖啡因[2-4，6-11]、葫芦巴碱[3-4]、奎宁酸[12]等，不仅研究咖啡饮品中功能成分的含量[2-3,9]，也研究咖啡生豆[5-6]、咖啡焙炒豆[7-8,11]、速溶粉[4,12]等中功能成分含量。而对引起咖啡酸味的脂肪族酸含量的报道很少。而柠檬酸、苹果酸等引起的这种酸味，可以使人愉快，是比较好的咖啡味道[13]。本研究采用高效液相色谱法，通过优化色谱条件，同时测定焙炒咖啡豆中酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、没食子酸、富马酸等6种有机酸含量，为健全咖啡豆质量评价标准、完善咖啡品鉴体系提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

戴安高效液相色谱仪(美国Thermo-U3000)，循环水真空泵(巩义予华SXZ-B3)，超纯水仪(力康Heal Force Easy15)，离心机(上海安亭TGL-16aR)。

1.2 试剂

焙炒咖啡：景兰咖啡(云南景兰热作科技有限责任公司生产)、埃塞俄比亚咖啡(Tomoca. Coffee Pvt. Ltd. Co.)、干法加工和湿法加工保山热经所办公楼前的咖啡；柠檬酸标准品、苹果酸标准品、富马酸标准品、酒石酸标准品、甲醇(色谱纯)、磷酸，由西格玛奥德里奇公司生产。

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 nm,5 μm),流动相：甲醇∶0.1%磷酸=25∶75，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm。

2.2 标准溶液和样品液的配制

2.2.1 混合标准溶液的配制 分别用移液枪吸取50 mg/mL苹果酸100 μL、25 mg/mL酒石酸100 μL、50 mg/mL柠檬酸80 μL、50 mg/mL富马酸(即反丁烯二酸)1 μL、50 mg/mL没食子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸)1 μL、62.5 mg/mL琥珀酸(即丁二酸)160 μL，置于高效液相样品瓶中，用甲醇(色谱纯)稀释至1 mL，摇匀即可。所得溶液中苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、没食子酸、琥珀酸的浓度分别为5、2.5、4、0.05、0.05、1 mg/mL。

2.2.2 样品液的配制 咖啡豆用咖啡磨3档磨碎，取咖啡粉5 g，置于50 mL的容量瓶中，用纯水定容，于40 ℃水温中超声5 min取出，摇匀，倒入1.5 mL的离心管，离心15 min。离心条件：转速10000 r/min，温度4 ℃。离心后过膜，取滤液作为样品溶液。平行3份。

2.3 样品提取方法的考察

2.3.1 咖啡粉的粗细 咖啡豆用1、3、4、5、6、7、8号档位研磨，8号咖啡粉最粗，1号咖啡粉最细。准确称量5 g咖啡粉共7份，分别用纯水溶解，定溶于50 mL的容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，重复测定3次峰面积，取平均值。测定结果见表1。在磨豆机3号档位时，咖啡粉在40 ℃水温中超声5 min时，各成分的含量最高，所以选择3号档位磨碎咖啡豆。

2.3.2 不同咖啡粉重量 咖啡豆用3号档位研磨，分别准确称量1、2、5 g咖啡粉各3份。用沸腾的纯水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，重复测定3次峰面积，取平均值。结果见表2。咖啡粉量为5 g时，各成分的含量最高，所以选择咖啡粉量为5 g。

表1 咖啡粉粗细的确定

2.3.3 提取温度 咖啡豆用3号档位研磨，准确称量5 g咖啡粉6份，分成2组。一组用沸腾的纯水溶解，一组用常温的纯水溶解，均定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，重复测定3次峰面积，取平均值，结果见表3。常温水中各成分含量最高，所以选择水温为常温。

2.3.4 提取时间 咖啡豆用3号档位研磨，分别准确称取5 g咖啡粉共7份。用纯水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声，分别超声提取5、10、20、30、40、50、60 min，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，测定峰面积，结果见表4。在咖啡豆用3号档位研磨时，超声5 min时，各成分的含量最高。因此，选超声时间为5 min。

表2 咖啡粉重量的确定

表3 纯水温度的确定

表4 咖啡粉提取时间的确定

2.4 含量测定

样品中有机酸的含量以1 kg所含的克数表示，具体计算公式如下：

其中：C由标准曲线求得某有机酸的体积，再计算某有机酸的浓度，单位为mg/mL；V为样品溶液定容体积，单位为mL，为50 mL；m为样品量，单位为g；1000为换算系数。

2.5 标准曲线的绘制

自动进样标准品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以标准品体积为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线[14]。

表5 6个标准品的标准曲线

2.6 精密度试验

咖啡豆用3号档位研磨，分别准确称取5 g咖啡粉。用纯水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，重复进样3次，测定峰面积，计算相对标准偏差(RSD)，精密度试验结果见表6。

表6 咖啡豆精密度试验结果

2.7 重复性试验

咖啡豆用3号档位研磨，分别准确称量3份5 g咖啡粉。用纯水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，测定峰面积，每份重复3次，计算相对标准偏差(RSD)，重复性试验结果表7。

2.8 稳定性试验

咖啡豆用3号档位研磨，准确称量3份5 g咖啡粉。用纯水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，分别在0、1、2、3 h进样1 μL，测定1次，计算该组含量的平均值及其相对标准偏差(RSD)。

表7 咖啡豆重复性试验结果

表8 咖啡豆稳定性试验结果

2.9 回收率试验

咖啡豆用3号档位研磨，取5 g咖啡粉，用纯水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水温40 ℃中超声5 min，按配制样品液的方法制备，再加入标准品溶液100 μL(酒石酸含量为0.5 mg、苹果酸含量为0.25 mg、柠檬酸含量为0.4 mg、琥珀酸含量为0.005 mg、没食子酸含量为0.005 mg、富马酸含量为0.1 mg)的样品瓶中,再加入样品液400 μL，分别进样4、6、8 μL，平行测定3次，试验结果见表9。

表9 6种有机酸的回收率

2.10 样品有机酸成分测定

取云南景兰热作科技有限责任公司的焙炒咖啡、埃塞俄比亚焙炒咖啡、湿法加工和干法加工的焙炒咖啡样品，按配制样品液的方法制备，进样1 μL，平行测定3次，试验结果见表10。

表10 样品有机酸成分检测结果 g/kg

3 讨论

(1)本文以酒石酸、苹果酸等6种有机酸为指标对提取工艺进行了优化。结果显示，常温水提取效率高于热水提取效率。故本试验采用常温水提取咖啡粉的方法。在此基础上，以料液比、提取时间、粉的粗细度为考察因素，优化提取工艺，最终选择咖啡豆提取工艺为1∶10的料粉比、水温40 ℃超声提取5 min、磨豆机3号档位的粉粗细度。

(2)液相色谱中酒石酸、苹果酸等6种有机酸均能达到基线分离，能较好地对酒石酸、苹果酸等6种有机酸进行定量检测，系统适用性较好。为了获得满意的分离效果，流动相比例进行了不同的尝试。在流动相甲醇∶0.1%磷酸=25∶75时，液相图谱各峰分离效果最好，故选择流动相为甲醇∶0.1%磷酸=25∶75。

4 结论

有机酸不仅是风味物质，也是重要的中药成分，在人体内可促进消化和维持酸碱平衡[15]。所以咖啡质量评价标准时应增加有机酸含量的测定，更加全面地了解咖啡。而该法简单、快速、灵敏度，6种有机酸得到很好的分离,适用于咖啡有机酸的分离和鉴定。

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