汤梦瑶，王海波，祁艳霞，李智博，李莹，赵前程

(大连海洋大学辽宁省水产品分析检验及加工技术科技服务中心，辽宁大连116023)

蛤Clam属软体动物门Mollusca、双壳纲Bivalcia无脊椎动物，是海洋滩涂贝类中最重要的经济品种[1]，在中国南北沿海地区均有养殖，主要分布在福建、河北、山东半岛、辽东半岛等沿海地区[2]的滩涂中。蛤类品种繁多，有文蛤Meretrix meretrix L.、青蛤Cyclina sinensis、菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum、四角蛤蜊 Mactra veneriformis和彩虹明樱蛤Moerella iridescens等，其适应能力强、新陈代谢旺盛、生长迅速、易于养殖[3]，近年来，耐低温蛤仔新品种也被不断培育出来[4]。蛤类养殖业现已发展成为中国贝类养殖业中的支柱产业，1993年产量突破100万t，并保持持续快速增长，2013年产量达到491.12万t[2]，占中国海水养殖产量的20%，占贝类产量的30%[5]。

中医理论认为，蛤肉有滋阴明目、强壮滋补、利尿通淋、软坚散结、化痰等功效[6]。蛤类肉质细腻、味道鲜美，富含蛋白质、多糖、矿物质等营养和功能成分。其中，蛤类多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和提高免疫等多种功效[7]，已成为多糖提取领域当前研究和开发的热点。蛤类多糖的提取、分离纯化技术不断取得新进展，多糖的化学组成和活性也不断被揭示。为此，本研究中从蛤类多糖提取、纯化、化学组成及其生物活性方面进行综述，旨在为蛤类加工利用及功能性食品开发提供理论参考。

1 蛤类多糖的提取方法

多糖是具有多种生物活性的天然大分子，广泛存在于蛤类等水产经济类中，目前，主要采用水提法、酸碱法、酶解法等方法提取多糖，详见表1。

1.1 水提法

多糖大多是易溶于水的大分子物质，水提法因设备简单，操作方便，被广泛用于蛤类多糖的提取。蒋长兴[7]从鲜青蛤中提取了多糖，提取条件为温度90℃，时间250 min，水煮2次，多糖提取率为1.95%；金燕等[8]从四角蛤蜊中提取了多糖，提取条件为水煮3次，4倍体积水，时间90 min，多糖提取率为0.55%；Wang等[9]进一步缩短了时间，优化了条件，建立了四角蛤蜊多糖的提取条件为水煮2次，3倍体积水，时间40 min，多糖提取率为1.21%，多糖提取率与蒋长兴[7]的研究结果相近。

为进一步提高多糖的提取率，目前常采用超声波辅助水提法提取多糖。胡伟等[10]采用此法提取了亚洲日月蛤Amusium pleuronectes多糖，多糖提取率为2.01%，较单纯水提法 (1.05%)提高了近1倍，提取条件为超声功率160 W，液固比40∶1，温度90℃，时间4 h。超声波辅助水提法在植物多糖提取上经常被采用，但该方法不适用于热敏性多糖提取[11]。研究表明：提取温度对多糖提取率有

显著影响，随着温度上升，多糖得率呈上升趋势，通常采用温度为90～100℃；一般提取时间在2～5 h内，随时间增加，多糖提取率升高[7]；提取次数也影响着多糖提取率，次数为2次以上较为合适[9]。至目前为止，水提法仍然是各种植物多糖提取中最常用的方法，也是目前提取多糖的最有效方法，它不仅在一定程度上提高了多糖提取率，而且可以得到纯度较好的多糖。该方法对富含蛋白质的蛤类来说效果更好，提取出的多糖纯度较高，适合规模化生产。

表1 蛤类多糖的提取及纯化Tab.1 Extraction and purification of clam polysaccharides

1.2 酸碱法

酸碱法也是多糖提取的一种方法，它的优点是可以有效去除部分蛋白，但由于糖苷键在酸碱水解条件下易断裂，如糖链中呋喃型糖苷键及链末端和支链上的一些糖苷键更易断裂[26]，所以应用较少。胡聪聪等[16]利用酸法 (盐酸)提取了青蛤多糖，工艺条件是料液比为1∶5，盐酸与水的体积比为1.2∶1，多糖提取率为1.82%；向维等[17]采用碱法 (氢氧化钠)提取了彩虹明樱蛤多糖，提取条件是温度为70℃，pH为8.0，时间为6 h，多糖提取率为1.17%。尽管酸碱法提取多糖的同时可以水解去除一部分蛋白质，但多糖提取率低，多糖纯度有待提高，且酸碱法较易导致多糖糖苷键的断裂[26]，为避免此种情况发生，一般不采用在强酸或强碱条件下提取多糖。

1.3 酶解法

蛤类由于富含蛋白质，多糖一般包埋或镶嵌在蛋白质内，为释放出更多的多糖，多采用蛋白酶将蛋白质降解成小分子，因此，酶解法成为富含蛋白质的动物性水产品多糖提取的常用方法。利用蛋白酶将蛋白质水解成小分子肽，便于多糖的分离，再采用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀、脱脂，就可以获得一定纯度的多糖。目前，常使用的酶制剂有胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等[27]。李莉[18]采用不同酶酶解处理文蛤，结果表明，胰蛋白酶多糖提取率最高，为13.5%，酶解条件为加酶量2.0%，料液比为1∶10，时间为4 h，酸性蛋白酶多糖提取率最低，仅为3.7%；为了缩短酶解时间，Liao等[21]采用超声辅助酶解法(木瓜蛋白酶)从河蚬Corbicula fluminea中提取了多糖，提取条件是时间为32 min，超声功率为300 W，提取温度为62℃，多糖提取率为1.72%。为了提高多糖的提取率，往往采用两种蛋白酶进行酶解提取多糖，孙晓朋[22]采用双酶 (枯草杆菌中性蛋白酶和胰蛋白酶)提取了四角蛤蜊糖胺聚糖，提取工艺条件是水料比为3∶1，酶解时间为3.5 h，酶添加量为 1.0%，糖胺聚糖的提取率为0.448%(鲜质量)。双酶法虽然在提取工艺上较单酶法复杂一些，但由于不同蛋白酶的酶解位点的特殊性，往往更有利于促进蛋白质水解，提高多糖的提取率，同时，也可以通过复合酶或风味酶减少苦味肽，获得风味较好的酶解液[18]，有利于海洋食品的开发利用。酶解法提取的多糖提取率比水提法高，推测原因可能是水提法仅可获得大部分的水溶性多糖，酶解法不仅获得了水溶性多糖，而且蛋白酶将蛋白剪切成小的肽段，使多糖溶出得更多，因此，酶解法较水提法提高了多糖提取率[12，18]。但水提法较酶解法提取的多糖纯度高[8，22]，推测原因一方面可能是酶解法中酶作用于蛋白质后，多糖连着蛋白 (或多肽)俗称糖蛋白 (肽)一起溶出，使多糖纯度下降，另一方面，水提法往往不需要将蛤类组织搅碎，而酶解法通常是将蛤类组织捣碎，以提高酶解效率。从蛤类蛋白质的高值化利用角度来说，采用酶解法不仅提高了多糖提取率，还可制备出具有多种生物活性的多肽片段，获得了目标性的生物活性多肽产品，这对提高蛤类产品附加值具有重要应用价值，因此，酶解法更适合蛤类加工和高附加值产品的生产。

2 蛤类多糖的纯化方法

经过水提法、酸碱法和酶解法提取的是蛤类粗多糖，其中仍含有一些杂质，需要进一步纯化，才能获得较高纯度的多糖，为进一步研究多糖的理化性质和生物活性奠定基础。

由于多糖提取过程中，蛋白质等会在多糖醇沉的同时一起沉淀出来，在多糖纯化前，常采用三氯乙酸法[9，24]和 Sevag 法[7，16]脱除蛋白。 Sevag 法是目前最为常用的蛋白脱除方法，具有成本低且适用范围广等优点，已被广泛应用于蛤类多糖的蛋白脱除中。孙晓朋[22]在用双酶法提取四角蛤蜊糖胺聚糖的基础上，采用吸附法、透析法和蛋白质等电点沉淀法脱除多糖中的蛋白质得到多糖G1，回收率为41.54%，糖胺聚糖含量由34.46%提高到82.92%，进一步采用CTAB铵盐络合沉淀法纯化，得到多糖G2，回收率达87.22%，糖胺聚糖含量由82.92%提高到95.03%。紫外扫描光谱显示，纯化后糖胺聚糖中蛋白质和核酸含量较低。

多糖纯化通常使用柱色谱法[6，24]。柱色谱法是利用物质不同的理化性质，使各个组分分散在两相(流动性、固定相)中，并以不同流速洗脱出来，从而实现有效分离[15]。利用柱色谱分离纯化时，柱体积、柱内填充物的体积，以及分离时间、洗脱梯度等均对分离纯化效果有较大影响。常用的柱色谱纯化方法主要有离子交换树脂法和凝胶过滤色谱法等，是当前应用最广泛且有效的分离纯化技术。蛤类多糖的提取也主要采用这两种纯化手段，也有人采用大孔树脂、交联葡聚糖凝胶等纯化方法，其中大孔树脂纯化手段一般用于植物多糖的分离纯化，在动物性多糖方面则应用较少，可将此法改进并应用于蛤类多糖规模化生产之中。与提取植物性多糖相比，蛤类多糖色素含量较少，多糖提取时通常不需要脱色环节，就可获得颜色浅白的粗多糖。

Dai等[28]利用DEAE-纤维素对三角帆蚌Hyriopsis cumingii多糖分离纯化，并进一步利用Sephadex-G200凝胶渗透色谱，得到了不含蛋白质的水溶性多糖组分；王瑞芳[29]将菲律宾蛤仔粗多糖经DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析纯化后，获得了单一组分多糖，总糖和蛋白质含量分别为52.3%和10.23%，糖胺聚糖含量为62.48%；董晓静[23]将提取的波纹巴非蛤Paphia undulata糖胺聚糖，采用DEA E-52-纤维素离子交换柱层析法进一步纯化，得到两个组分，蛋白质含量分别为10.3%和9.4%，总糖胺聚糖含量分别为68.3%和62.8%，两个组分均具有酸性多糖的特征吸收。Wang等[9]利用DEAE-纤维素对四角蛤蜊中多糖进行分离纯化，得到3种多糖 (MVPS-1、MVPS-2和MVPS-3)，3个组分的多糖含量均超过99.8%，且3种多糖只含有一种单糖残基，MVPS-2不含糖醛酸或糖蛋白，它们属于葡聚糖同系物。因此，蛤类多糖可先采用DEAE-52纤维素离子交换柱分离，再进一步采用凝胶柱层析分离纯化，可以得到纯度较高的多糖，这种纯化方法操作简单，技术成熟。舒留泉等[20]利用DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephdex G-200纯化四角蛤蜊多糖，经过DEAE-Sepharose Fast Flow胶分离纯化了岩藻聚糖硫酸酯，且洗脱液未检测到蛋白和核酸，收集液继续通过Sephdex G-200凝胶过滤色谱进行分离，在220 nm波长下只出现一个对称的吸收峰，多糖得到了进一步的纯化。目前，凝胶色谱在多糖分离纯化方面应用最为广泛，通过多次凝胶色谱可以使多糖的分离纯化更为彻底。

3 蛤类多糖的化学组成

研究表明，多糖的许多生物活性与其单糖组成、主链糖苷键类型和糖链中支链情况紧密相关[30]，分析多糖的化学组成是研究其结构及生物活性的必要前提。纯化后的蛤类多糖可采用化学测定法、高效液相色谱法、气相色谱法等方法测定其化学组成，以便进一步深入研究多糖的结构和活性。

利用多糖特定的化学反应，可以测定多糖的化学组成及多糖含量。范秀萍等[19]利用化学法测定了纯化的菲律宾蛤仔多糖的组成成分，证明其主要单糖为己糖醛酸，含量为29.5%，其次为氨基己糖 (14.8%)、半乳糖 (6.7%)、岩藻糖 (1.8%)和硫酸基 (5.1%)；吴红棉等[31]研究了波纹巴非蛤多糖中的化学成分，发现多糖组分与菲律宾蛤仔多糖的单糖组成相似，但氨基己糖和半乳糖含量却提高了1倍，分别为34.8%和14.8%，而己糖醛酸的含量较低，仅为7.8%，与菲律宾蛤仔相差较大，另外，还有少量硫酸基和岩藻糖[19]。

目前，在多糖化学组成的分析中最常用的手段为色谱法，主要为气相色谱法和液相色谱法。由于该方法具有高效、准确和快速等优点，被广泛应用于分析多糖的化学组成。廖宁波[24]利用液相色谱法研究了河蚬多糖化学组成主要为岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等；郭振宇[32]利用液相色谱法对菲律宾蛤仔蒸煮液中提取的多糖的两个组分进行了分析，结果均以葡萄糖为主，其中一个组分还含有甘露糖、D-葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、D-半乳糖和L-岩藻糖；王瑞芳[29]证明了菲律宾蛤仔多糖组分的化学组成是以氨基己糖和己糖醛酸为主，并含有大量的硫酸基，中性己糖含量较少，液相色谱分析其单糖组成为葡萄糖、氨基半乳糖和半乳糖，三者含量分别为6.11%、0.86%和0.48%，红外光谱图显示，菲律宾蛤仔糖胺聚糖具有-OH、-NH、-COO-、-SO3H、C-O-C等糖胺聚糖的特征基团，该多糖组分的主链主要由葡萄糖、半乳糖和糖醛酸构成；Wang等[33]利用高效液相色谱法分析了四角蛤蜊的单糖组成均为葡萄糖低聚糖；也有学者利用薄层层析法 (TLC)鉴定了四角蛤蜊精多糖的单糖组成主要为葡萄糖[8]。蛤类多糖的单糖组成差异较大，除了原料种类的原因外，主要是由于提取和分离纯化方法的不同引起的，高效液相色谱法至今仍然是目前最准确、快速、简便测定多糖的单糖组分的方法，可以广泛应用于蛤类多糖的单糖化学组成分析中。

4 蛤类多糖的生物活性

多糖广泛存在于各种生物体内，具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗病毒等多种生物活性[34]，因此，其生物活性受到广泛关注，研究也不断深入，但由于纯化手段限制，高纯度多糖难以得到，同时，提取纯化过程中改变了多糖的结构和组成，因此，其构效关系、活性机制尚不明确，功能性产品的开发甚少，需要对其进行深入研究。

4.1 抗肿瘤

抗肿瘤活性是近年来最受关注的多糖生物活性之一，科学研究证实了蛤类多糖也具有此活性。蛤类多糖抗肿瘤活性与多糖结构和组成有密切关系，吴红棉等[31]、范秀萍等[19]研究发现，利用酶解法分别从波纹巴非蛤和菲律宾蛤仔中提取的氨基多糖均对HL-60癌细胞具有一定的抑制作用，菲律宾蛤仔氨基多糖1.0 mg/mL剂量组72 h抗肿瘤活性可达96.2%，显著高于波纹巴非蛤氨基多糖，通过对其化学组分的分析发现，两者单糖组成有一定的相似性，其活性差距可能与单糖间糖苷键的结合方式有关。

蒋长兴[7]研究发现，利用水提法提取的青蛤多糖及其硫酸酯化产物均对胃癌细胞 (BGC-823)的增殖有抑制作用，并随其浓度不断升高而增强，且不同多糖组分抑制率不同，这可能与其单糖组成、硫酸基取代位置等有关。

蛤类多糖可通过增强免疫机制间接抑制肿瘤生长，从而实现抗肿瘤作用。窦昌贵等[35]对文蛤多糖抗肿瘤活性的研究表明，利用酶解法提取的文蛤多糖可降低小鼠S180实体瘤质量，延长艾氏腹水瘤 (EAC)和肝癌腹水瘤 (HepA)小鼠生存时间，对肿瘤有治疗作用，且对免疫低下的小鼠具有保护作用，这对新型抗癌药的开发有一定指导意义。

4.2 免疫调节

蛤类多糖能有效激活免疫细胞，提高机体的免疫能力，且对正常宿主细胞无毒副作用，是潜在的免疫调节剂。向维等[36]通过多项指标研究了用水提法提取的彩虹明樱蛤多糖对正常小鼠免疫功能的影响，表明彩虹明樱蛤多糖对小鼠脾脏发育有促进作用，并能使小鼠单核巨噬细胞吞噬指数增加，体液和细胞的免疫功能均有增强；郑文文等[37]对水提法提取的四角蛤蜊多糖活性进行了研究，发现其对正常小鼠单核巨噬细胞有增强作用，对免疫力低下小鼠也具有显著提高免疫力的作用，其免疫调节功能与剂量有一定依赖性。研究表明，蛤类多糖为有效的免疫调节剂，但其作用机制有待进一步研究。

4.3 抗氧化

多糖的抗氧化活性与清除体内自由基和抗脂质过氧化密切相关。郭雷等[38]对用水提法提取的青蛤粗多糖的体外抗氧化活性进行了研究，发现用水提法提取的青蛤多糖对羟自由基、超氧阴离子()和1，1-二苯基-2-三硝基肼 (DPPH)自由基均具有清除效果，且随浓度增大而增强，其对应的IC50分别为12、10、1.25 mg/mL，对DPPH自由基的清除活性显著优于维生素C；蒋长兴等[39]对海蚬多糖的抗氧化活性进行了研究，通过测定还原力、金属离子螯合能力和脂质过氧化抑制活性，发现海蚬多糖不同组分具有不同抗氧化活性；孙晓朋[22]研究了用酶解法提取的四角蛤蜊糖胺聚糖抗氧化活性，羟基自由基清除率的IC50为15.4 mg/mL，但弱于维生素C；董晓静[23]利用酶解法提取波纹巴非蛤糖胺聚糖，发现其对羟自由基、超氧阴离子和DPPH自由基清除率的IC50分别为4.23、3.19、4.36 mg/mL，表现出较好的抗氧化活性。综上所述，蛤类多糖具有一定的抗氧化活性，其活性强度可能与单糖组成和结构有关，但抗氧化作用机制尚不明确，需要进一步探讨。

4.4 降血脂、血糖

自由基和过氧化物是引起动脉硬化的主要因素，而动脉硬化是高血脂发病的主要因素，研究证明多糖可以有效清除自由基和过氧化物[40]。范秀萍等[40]发现，酶解法提取的波纹巴非蛤糖胺聚糖粗多糖400 mg/kg剂量，能明显降低高脂模型小鼠血清中的TC、TG、LDL和LDL/HDL水平，提高HDL水平，表明用酶解醇沉法提取的波纹巴非蛤糖胺聚糖有较好的降低血脂与预防动脉粥样硬化作用，这与董晓静[23]发现的波纹巴非蛤糖胺聚糖具有降血脂活性的研究结果相似；董文南等[41]研究了四角蛤蜊粗多糖的活性，指出其能有效降低小鼠GSP、TCH和TG水平，且降血糖作用明显。

4.5 抗病毒

多糖具有抗人类免疫缺陷病毒 (HIV)作用，其机制是通过与HIV外膜蛋白或T细胞某些敏感结构域相互结合或融合，从而阻断HIV与细胞结合，达到抑制HIV病毒的作用[42]。Woo等[43]发现，文蛤多糖有明显抑制HIV的效果，而彩虹明樱蛤多糖则具有明显的抗乙型肝炎病毒 (HBV)的活性[42]。

4.6 保护肝脏

贝类多糖具有保护肝脏的功效，彩虹明樱蛤和海蚬多糖对CCl4诱导小鼠急性肝损伤均有保护作用，护肝作用可能与抗氧化作用有关[44]。

5 存在的问题及展望

近年来，蛤类功能性成分的研究和开发在国内受到广泛关注，但国外对蛤类研究较少，蛤类多糖方面的研究更为少见。中国科研工作者在蛤类多糖的提取、纯化、化学组成及活性等方面开展了大量研究工作，取得了一定成果，为蛤类多糖市场开发奠定了一定的理论基础。但是，该领域仍存在一些需要解决的问题，一是蛤类多糖的提取和纯化目前仍停留在实验室阶段，多糖提取时间长，提取率和纯度低，急需提取方法及提取工艺的创新；二是蛤类多糖主要停留在化学成分如单糖组成的分析，对多糖结构及其构效关系、活性机制尚不明确，不同提取、纯化方法得到的多糖对其生物活性的影响还需要进一步阐释和深入研究。但是，随着人们健康意识的不断增强，对多糖类功能性食品的需求日益增大，国际市场对活性多糖产品的需求呈快速增长的发展趋势，活性多糖成分的开发具有巨大的发展空间，将成为抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等功能性产品的重要功能原料。蛤类因其价格和成本低廉，资源丰富，药用和食用价值高，活性明确[45]，将成为多糖原料的重要来源。

随着对蛤类研究的不断深入，除了多糖以外，新的活性被不断挖掘，最新研究表明，青柳蛤Mactra chinenesis酶解物具有明显的辅助降血压作用，血管紧张素转换酶 (ACE)抑制率达到52%[46]，另外，蛤类含有丰富的呈味物质核苷酸[47]，这也为蛤类高效开发利用开辟了新的发展方向。

从蛤类产量看，中国蛤类产业在全球占绝对优势[48]，但在经济效益上并未处于优势，因此，需通过综合高效加工，提高产品附加值，促进中国的蛤类由规模资源优势转化成效益优势。目前，国家提出向深海进军，加大海岸、滩涂和近海的修复力度，促进海洋生态环境建设，这更有利于蛤类产业的发展，因为蛤类不仅具有较强的适应性，而且具有较强的富集重金属能力[49-50]，是清除滩涂环境污染的重要海洋生物，也是重金属污染的指示性海洋生物，对于修复海洋环境具有重要生态作用。滩涂经济发展应坚持生态优先，稳产量、保质量、增效益[48]，从这种意义上讲，蛤类是最适宜的海洋经济品种，通过蛤类增养殖提高生态效益，通过蛤类精深加工增加经济效益，蛤类产业将有极大的发展空间。

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