刘满光，路文雅，李国松

(1.河北省林业科学研究院，河北 石家庄 050061；2.河北省林木良种工程技术中心，河北 石家庄 050061；3.河北省林木种苗管理站，河北 石家庄 050091)

油松Pinustabulaeformis是我国非常重要的造林和园林绿化树种。油松枯梢病(Sphaeropsissapinea)是油松主要病害之一，该病又称溃疡病，分布广泛，危害严重，发病症状主要有叶枯、流脂、芽枯及梢枯等，可危害幼苗及大树的嫩叶、嫩枝、嫩芽和幼果等，影响松树的生长和产量，严重时导致整株树木枯死[1-2]。目前，油松枯梢病主要采取化学防治，但化学农药存在污染环境、持效性差以及易产生抗药性等问题。

亚磷酸盐是一种非农药化合物，由亚磷酸与碱反应合成，常用作还原剂和农药中间体，不仅可以作为肥料被植物吸收利用，而且具有诱导性抗病功能[3]，它可以在病菌入侵时刺激植株产生植物防御素，从而预防病虫害，增强树势。亚磷酸盐在植物体内持效期长[4]，因此具有持久的肥效和杀菌特性。目前，亚磷酸盐已经被广泛应用于疫霉菌Phytophthora的防治[5]，对玉蜀黍赤霉Gibberellazeae、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大丽轮枝菌Verticilliumdahliae及禾谷丝核菌Rhizoctoniacerealis均有抑制效果[6]。据报道，亚磷酸钾是多种杀菌剂及肥料的活性成分，但其对油松病害防治效果鲜有报道。

作者通过室内采用菌丝生长速率法和凹玻片法测定亚磷酸钾对油松枯梢病原菌菌丝生长及孢子萌发的抑制作用，林间施用亚磷酸钾复配剂后测定油松树干单位电容、松针钾(K)、磷(P)元素含量、超氧化物歧化酶(SOD)及多酚氧化酶(PPO)活性，旨在为防治油松枯梢病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 油松枯梢病菌Sphaeropsissapinea由河北省林业科学研究院森林保护研究所实验室分离保存备用；油松枯梢病松针采自秦皇岛联峰山公园。

供试药剂：亚磷酸钾(K2HPO3)、硝酸铵(NH4NO3)、硫酸镁(MgSO4)、硝酸(HNO3)，天津希恩思生化科技有限公司；杰效利(非离子表面活性剂)，迈图高新材料(南通)有限公司；K、P标准溶液(浓度均为1 000 mg/L)，信阳时得佳实业有限公司。

仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、人工气候箱、LCR电桥、电热鼓风干燥箱、微波消解仪、电感耦合等离子体发射光谱仪、组织破碎仪、冷冻离心机等。

1.2 方法

1.2.1 菌丝生长的测定 根据预试验结果，将亚磷酸钾试剂配成5个浓度梯度(表1)的母液备用。采用菌丝生长速率法[7]，将10 mL母液倒入灭菌熔融状态的90 mL PDA培养基中，摇匀后倒入直径9 cm培养皿内，冷却凝固。用直径5 mm的打孔器在已培养3 d的油松枯梢病原菌菌落边缘取菌饼，接种于含试剂PDA培养基中间，置于25 ℃恒温箱内黑暗培养3，5，7 d后，十字交叉法测量菌落直径取平均值。每处理重复3次，以加10 mL无菌水的培养基为对照。计算亚磷酸钾对菌丝生长的抑制率。

菌丝生长量=菌落平均直径-菌饼直径

菌丝生长抑制率(%)=(1-试剂处理菌落增长直径/对照菌落增长直径)×100

1.2.2 孢子萌发的测定 取适量油松枯梢病松针用无菌水冲洗干净，0.1%的升汞表面消毒30 s，无菌水冲洗3次，放置在无菌培养皿中，用接种针挑取其成熟的分生孢子器，轻轻按压，并加入适量无菌水浸泡，使分生孢子完全释放于无菌水中，配成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液，存于-4 ℃冰箱中备用。采用凹玻片法[8]，将孢子悬浮液及配好的5.6，11.2，22.4 g/L 3个浓度梯度的亚磷酸钾药液各0.02 mL，滴于盖玻片上混匀，翻转平放于凹玻片凹槽上，放在铺有湿润滤纸的培养皿中，用保鲜膜保湿，置于25 ℃培养箱中恒温光照培养，每处理3次重复，无菌水为对照。每隔8 h镜检1次，共3次。每个载玻片观察5个视野，记录孢子萌发数量，计算萌发率及萌发抑制率。

孢子萌发率(%)=萌发的孢子数/孢子总数×100

孢子萌发抑制率(%)=(1-试剂处理孢子萌发量/对照孢子萌发量)×100

1.2.3 林间树干单位电容测定 亚磷酸钾20%、硝酸铵10%、硫酸镁4%、杰效利1%以及水65%进行复配，在河北省秦皇岛市联峰山公园内，选择油松枯梢病均匀的油松地块，用自流式树干注药技术施药[9]。复配药剂注射量1.0 mL/cm(胸径)。试验组记为T1，对照组为清水，记为CK。参照梁军[10]的方法用LCR电桥测定并记录树干电容，时间为5月6日至10月21日，每14 d调查1次，共13次。树干电容与树木胸径的比值即为单位电容(nF/cm)。

1.2.4 钾、磷含量的测定 经1.2.3中复配剂施药后，采集试验组和对照组油松松针，去除根部毛蒂，放在80 ℃的电热鼓风干燥箱中5 h，凉至室温，用料理机粉粹至粉末状，量取0.4 g于微波消解仪的消解罐内，加硝酸10 mL，消解后赶酸，定容至50 mL，用电感耦合等离子体发射光谱仪测定结果，试验时间为5月6日至10月21日，每28 d测1次，共7次。钾分析线766.4 nm，磷分析线178.2 nm。

1.2.5 酶活性的测定 经1.2.3中复配剂施药后，采集试验组和对照组油松松针，每次称取0.2 g，表面冲洗干净，再用无离子水冲洗2～3次，吸水纸吸干表面水分。酶液提取参考罗广华的方法[11]，SOD活性测定参考植物生理学实验指导[12]的氮蓝四唑(NBT)法，PPO活性测定参考张茜[13]的方法。试验时间5月6日至10月21日，每14 d测1次，共13次。酶活性单位μg/g。

1.2.6 数据统计与分析 用Excel软件整理录入数据，DPS 7.05、SPSS 19.0软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 亚磷酸钾对油松枯梢病原菌菌丝生长的影响 5种浓度亚磷酸钾对油松枯梢病菌菌丝的生长均有一定的抑制作用，抑制率随浓度的增加而增大，随时间的延长而下降，其中，浓度28 g/L，第3天的抑制率最大，为95.51%(表1)。毒力回归方程表明对菌丝生长的EC50随时间的增加而增大，3天的EC50最小，为7.360 g/L(表2)。

表1 亚磷酸钾对油松枯梢病原菌菌丝生长的抑制

注：同列数据后不同字母表示差异显著 (P<0.05)。

表2 亚磷酸钾对油松枯梢病原菌菌丝生长的EC50

2.2 亚磷酸钾对油松枯梢病原菌孢子萌发的影响 各浓度亚磷酸钾对油松枯梢病菌的孢子萌发均有一定的抑制作用，抑制率随浓度的增加而增大，随时间的延长而增加，其中，药剂浓度22.4 g/L，24小时的抑制率最大，为50.84%(表3)。毒力回归方程表明孢子萌发抑制率的EC50值在24 h内随时间的增加而减小，24 h时EC50值最小，为19.058 g/L(表4)。

表3 亚磷酸钾对油松枯梢病菌孢子萌发的抑制作用

注：同列数据后不同字母表示差异显著 (P<0.05)。

表4 亚磷酸钾对油松枯梢病原菌孢子萌发的EC50

2.3 亚磷酸钾复配剂对油松树体干部单位电容的影响 试验开始时试验组与对照组单位电容无显著性差异，均随时间的延长呈先上升后下降趋势(图1)。对照组单位电容7月15日达到最高值，为0.998 nF/cm；试验组单位电容7月29日达到最高值，为1.191 nF/cm，且自6月3日开始试验组单位电容均显著高于对照组，说明亚磷酸钾复配剂有增大树体干部电容的作用，且持效期较长。

图1 亚磷酸钾复配剂对油松树体干部单位电容影响

2.4 亚磷酸钾复配剂对油松松针K、P元素含量的影响 对照组K元素含量随时间的延长先下降后上升，试验组则随时间的延长先上升后下降(图2)。对照组与试验组P元素含量均随时间的延长先下降后上升(图3)。试验开始时对照组K、P元素含量均高于试验组，7月1日后试验组均高于对照组。试验结束时对照组K元素的含量降低了47.47%，P元素含量降低了51.43%；试验组K元素含量降低了26.83%，P元素含量降低了19.35%。

图2 亚磷酸钾复配剂对油松松针K元素含量影响

图3 亚磷酸钾复配剂对油松松针P元素含量影响

2.5 亚磷酸钾复配剂对油松SOD及PPO活性的影响 试验开始时试验组与对照组SOD活性无显著性差异，变化趋势基本一致，均随时间的延长先降低后升高，其中7月15日SOD活性最低，分别为387.95 μg/g和651.11 μg/g。方差分析表明，5月20日至8月26日试验组SOD活性显著高于对照组，8月26日后差异不显著(图4)。试验开始时试验组与对照组PPO活性无显著差异，变化趋势基本一致，随时间的延长整体均呈上升趋势。方差分析表明，6月3日后试验组PPO活性显著高于对照组，10月21日达到13.37 μg/g(图5)。

图4 亚磷酸钾复配剂对油松松针SOD活性影响

图5 亚磷酸钾复配剂对油松松针PPO活性影响

3 结论与讨论

试验结果表明，亚磷酸钾对油松枯梢病原菌菌丝生长及孢子萌发均有一定的抑制作用，抑制效果均随药剂浓度的增加而增大，对菌丝生长的抑制率可达90%以上，对孢子萌发抑制率可达50%以上，这与亚磷酸盐可直接作用于病原菌[14]的研究结果相似，但其抑菌机制还需进一步研究。试验组树干单位电容高于对照组，且K、P含量较对照组稳定，说明亚磷酸钾复配剂能够增大树体干部单位电容，同时能被油松吸收转运，为其补充K、P元素。试验组SOD及PPO活性均高于对照组，说明亚磷酸钾复配剂可以促进SOD活性升高，能够在短时间内增强抗性，同时能显著提高PPO活性，且持效期较长，能够长时间提高油松抗性，增强树势。

试验中油松松针SOD活性呈先下降后上升趋势，可能是由于5月到7月中旬比较适合油松生长，此时油松体内活性氧自由基的产生和消除处于平衡状态，植物体内活性氧自由基的浓度较低[15]，所以SOD活性下降；随着气温逐渐下降，油松体内的生理代谢活动减弱，打破了活性氧的产生和消除的动态平衡，使植物体内积累了较多的自由基，此时SOD活性升高。试验中PPO活性整体呈上升趋势，气温升高，PPO活性也上升，原因是PPO酶活性与油松的抗热、抗旱性相关；随着气温的逐渐降低，松针逐渐衰老，此时PPO活性升高是油松松针抗寒性的反应，同时可以防御病虫害，增强抗性。

本试验利用亚磷酸钾等多种化合物复配，对病害的抑制及树势的增强具有协同增效作用，且复配剂所用原料对环境无污染、无残毒，配制工艺简便，成本较低，生产效率高，为开发防治油松枯梢病、提高油松树势的环境友好型试剂奠定了基础。