张荣华 ，王 曦 ，郑彦伟 ，李武峰

（1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032；3.和顺县农业委员会，山西 和顺 032700）

黑山羊主要分布在云南、四川等海拔1 200～3 000 m的丘陵和山区地带，而吕梁黑山羊是我国北方山区的优良种质资源之一，历史悠久，地域性强[1]。该品种外形独特、肉质鲜美，对常年低温、四季降雨量变化大的气候环境和高低不平的地势、植被稀疏的地理环境都有着良好的适应能力。由于吕梁黑山羊属肉皮绒毛兼用型山羊，具有较高的经济价值，再加上其抗寒、抗病、耐粗饲，故培育优良品种及其推广就显得尤为重要。早在1983年，吕梁黑山羊被列入《山西省家畜家禽品种志》[2]。当时，该品种占山西全省山羊总数的40.7%，而近些年来，虽然对家畜动物的育种、繁殖发展迅猛，但对该种质资源的保护、选育和利用少之又少，更缺乏对其的研究，很多问题亟待解决。据2010年底统计，中心产区吕梁市黑山羊存栏数由从前的107万只骤降至不足0.6万只，濒临灭绝[3]。

成纤维细胞因其容易分离、培养、操作的特性，常常被当作供体细胞进行核移植，培育克隆动物。体细胞克隆是将动物体细胞移植到去核卵母细胞中，融合激活，体外培养发育成新的个体。自1996年第1只克隆羊多利诞生以来，利用成纤维细胞已经成功克隆出梅山猪[4]、山羊[5]、和牛[6]等等。但是大多数克隆所用的成纤维细胞取自胎儿，而使用出生后个体可以简化试验步骤，避免伤害怀孕母畜。

本试验旨在建立、完善吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞培养体系，为进一步的克隆试验提供供体细胞[7]。以3月龄的吕梁黑山羊耳缘组织为试验材料，体外制备、分离、培养成纤维细胞，对血清体积分数因素进行探究，使用活体检测细胞数量，以求寻找最合适的条件，为进一步研究吕梁黑山羊的克隆、基因转染、构建基因文库等提供生物学材料。

1 材料和方法

1.1 材料

供试羊只来自山西省农业科学院畜牧兽医研究所吕梁黑山羊克隆基地。

1.2 主要试剂与仪器

胰蛋白酶（Serva公司）、DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS，Gibco）、碳酸氢钠（Sigma）、注射用青霉素钠、DMSO（Sigma）、两性霉素 B（Blotapped）、注射用硫酸链霉素、PBS（1×PBS，pH 值 7.2～7.4，Solarbio）、生理盐水、双蒸水、新吉尔灭、酒精，均为国产试剂。

微量移液器（Eppenderf公司，10，100，200，1 000 μL 型）、高速低温离心机（Sigma，2-16PK型）、CO2培养箱（Therm oF orma，3131型）、电子天平（METTLER TOLEDO，AL104-IC型）、体式显微镜（OLYMPUS，SZX10型）、恒温板（OLYMPUS）、摩尔基因型超纯水机（上海摩勒生物科技有限公司，MO6-063型）、立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS-SⅡ型)、电热恒温鼓风干燥箱（上海联进医疗器械厂，101-2-BS-Ⅱ型）、电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司，DK-8D型）、超净工作台（苏净安泰公司）、超低温冰箱（中科美菱公司）、CK40-32PH型倒置相差显微镜（OLYMPUS），CK41型荧光倒置相差显微镜（OLYMPUS），MP120型便携式酸度计（Thermo）。

DMEM溶液：将10 gDMEM粉末溶于800 mL纯水中，加3.7 gNaHCO3，调节pH值至7.2～7.4，定容至1 L。经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用。

细胞培养液：（1）FBS体积分数为0的培养液为 DMEM 29.3 mL＋15%（V/V）FBS 0 mL＋两性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋双抗 400 μL；（2）FBS 体积分数为5%的培养液为DMEM 27.8 mL＋15%（V/V）FBS1.5 mL＋两性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋双抗 400 μL；（3）FBS 体积分数为 10%的培养液为DMEM26.3 mL＋15%（V/V）FBS 3.0 mL＋两性霉素300 μL（0.05 μL/mL）＋双抗 400 μL；（4）FBS 体积分数为20%的培养液为DMEM 23.3 mL＋15%（V/V）FBS6.0 mL＋两性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋双抗 400 μL；（5）FBS 体积分数为 40%的培养液为DMEM 17.3 mL＋15%（V/V）FBS 12.0 mL＋两性霉素 300 μL（0.05 μL/mL）＋双抗 400 μL 。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 采集3只（1只公羊，2只母羊）3月龄吕梁黑山羊耳缘组织，除去耳缘羊毛，用75%酒精擦拭，碘伏消毒后再用酒精棉球脱碘。用采样钳取1 cm2左右大小的耳缘组织，置于加有PBS（含100 IU/mL青霉素＋100 IU/mL链霉素）的采样管中，封口膜封口，记录采集样品的羊只耳号。将采样管投入4～8℃保温瓶中，旋紧瓶盖，1 h内运回实验室。

1.3.2 成纤维细胞培养 在超净台及实验室紫外线消毒30 min，37℃孵育细胞培养液和PBS缓冲液2 h。

细胞制备：在超净台中将耳缘组织块用75%酒精浸泡30 s。将样本置入加有PBS的无菌培养皿中，刮除遗留毛根，去除软骨组织，用PBS液冲洗10次；再用培养液浸泡2遍；将样本移入35 mm培养皿中，剪碎（1 mm2左右），均匀分布在皿底，密度不宜过大；最后将培养皿倒置入38.5℃，5%（V/V）CO2和90%相对饱和湿度的培养箱中培养1 h，待样本组织块贴壁。显微镜观察，确定贴壁后每皿加入1 mL的FBS体积分数为10%的培养液，重新放入培养箱[8]；组织块培养6 h后，每皿加入2 mL的FBS体积分数为10%的培养液；2 d后观察有无污染，有无细胞迁移出。原代培养的成纤维细胞贴壁、呈放射状，待3～4 d后细胞汇合，呈长梭状。

细胞换液：每2 d换一次培养皿中的10%FBS细胞培养液，每皿2 mL，培养液要提前孵育2 h。由于原代细胞生长缓慢，每2 d观察一次有无细胞迁出。

传代培养：待原代细胞汇合度达到80%～90%时进行传代培养。在无菌操作台中，将培养皿中的废液弃去，使用PBS清洗3遍，以去除残留血清。然后每皿加入1 mL的胰蛋白酶消化液消化，置于38.5℃，5%（V/V）CO2和90%相对饱和湿度的培养箱内1 min后，显微镜下观察细胞形态变化，待约80%细胞变圆、漂浮后，每皿再加入2 mL加有血清的DMEM培养液终止消化。集中吹打组织块周围多次，待大部分细胞悬浮后，吸取上清液加入15 mL离心管，用PBS洗涤培养皿3次，将洗涤液加入离心管；1 000 r/min离心5 min，小心弃去上清液后，用200 mL培养液悬浮沉淀后加入培养皿中，用培养液洗涤离心管3次，加入培养皿使皿中液体混合均匀，显微镜下观察细胞的数量。使用血球计数板和0.4%台盼蓝染液进行活细胞计数，使细胞密度达到60%，并置于37℃，5%（V/V）CO2和90%相对饱和湿度培养箱中分皿继续培养。操作过程在恒温板上进行。

传代后每天观察细胞的生长情况。大部分传代细胞在12 h内逐渐贴壁。此时，显微镜可明显观察到有丝分裂各期细胞的分裂相。同时，培养基中有少量悬浮细胞，这些细胞在传代过程中受损而死亡（造成这种损伤的原因可能是机械损伤、胰蛋白酶消化等）。它们可在下次换液时一同弃去。细胞传代后生长状况良好，速度较原代要快，且具有典型的成纤维细胞形态。

1.3.3 不同体积分数FBS下培养成纤维细胞 取正处于对数期的第3代成纤维细胞，每皿中加入1 mL胰蛋白酶消化液消化，1～2 min后每皿加入2 mL培养液终止消化。1 000 r/min离心5 min，弃上清，然后分别以不同体积分数（0，5%，10%，20%，40%）的FBS培养液重悬细胞，转移至24孔细胞板，通过0.4%台盼蓝染色和血球计数板控制每孔1.3×105个细胞。置于 37 ℃，5%（V/V）CO2和 90%相对饱和湿度培养箱中培养。

1.3.4 细胞计数 连续7 d在相同时间使用倒置显微镜进行细胞形态观察，拍照记录，并进行活体计数、处理（图 1～3）。

活体计数：血球计数板和盖玻片先用酒精清洁、干燥；然后将少量等体积的细胞悬液和0.4%台盼蓝染液混合均匀染色，静置2～3 min；轻轻吹打混合液，吸取少量液体滴在盖玻片一侧，注样量不要溢出盖玻片且不宜带气泡；待液体进入计数室时计数，死细胞为蓝色，活细胞为无色透明。统计四角大方格中活细胞数，若细胞压中线，计左和上方数。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件（Duncan法）进行差异显著性检验。

其中，DT表示细胞倍增时间，t为培养时间，N0为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。

2 结果与分析

2.1 细胞形态学观察结果

用胎牛血清体积分数分别为0，5%，10%，20%，40%的培养液培养成纤维细胞的情况各不相同，所有试验组细胞均在培养6 h后贴壁，形态良好，成梭形，透亮折光度较好。其中，10%试验组细胞能看到细胞中心的细胞核；40%试验组细胞最早出现大量细胞形态不完整、细胞悬浮等现象；每组当培养皿底铺满80%时，发生接触抑制，生长趋势缓慢[12]。

2.2 台盼蓝染色检测活细胞数目结果

每组差别较大，根据FBS体积分数的不同，以培养天数为横坐标，耳缘成纤维细胞数量为纵坐标绘制曲线（图4）。由图4可知，0培养组细胞生长缓慢，数量少，细胞状态也没有明显变化。5%，10%和20%血清体积分数培养组细胞生长状态良好，在3～5 d时达到对数生长期，生长速度较快，平均细胞数目多，其中，生长趋势最好的是10%试验组，活细胞最多，细胞生长曲线呈S形；其次是5%试验组，细胞状态良好，但5 d后细胞增长没有10%试验组的细胞迅速；5 d后，这3组培养组的细胞生长趋势变缓，最为明显的是20%培养组，死亡细胞数目增多，可能与细胞膜受损有关[13]。而40%培养组由于血清浓度过高，细胞数量的增加几乎处于停滞状态，维持一段时间后从第3天就开始衰退，且5～7 d比3～5 d衰退迅速，在5组中细胞数量最少，长势最差。综上所述，培养液中FBS的体积分数对成纤维细胞生长影响较明显。FBS体积分数为5%，10%，20%试验组对细胞生长状况的影响差异不显著（P＞0.05），其中，10%培养组对细胞生长最有利；但三者与0，40%试验组间差异显著（P＜0.05），且0与40%试验组间差异也显著（P＜0.05）。

3 讨论与结论

哺乳动物克隆是近年来生物领域的研究热点[14]。克隆技术不仅可用于改良优化品种、保护濒危动植物，也可用于治疗疾病、针对性生产生物反应器等[15]。耳缘成纤维细胞作克隆供体细胞具有一定的优势，它易分离、易培养，同时增殖能力较强，即使多次传代后细胞状态和增殖能力仍良好。而血清是培养供体细胞最有效的生物液体之一[16]。其中的生长因子、激素等物质对成纤维细胞的生长具有重要作用。但血清的成分复杂，也包含很多有害因子，如血清细胞毒作用等[17]。所以，血清体积分数对培养成纤维细胞至关重要。

本试验发现，不同体积分数血清的培养液对黑山羊耳缘成纤维细胞有一定影响。0血清体积分数组，细胞由于无血清，营养低，所以数量变化小；5%血清体积分数组细胞数量比0多，状态好，可增殖，但仍比10%，20%组慢；10%和20%血清体积分数组的细胞状态较好，数量较多，但20%组后期可能有膜受损现象，衰亡的比较多。由台盼蓝染色可知，10%试验组是5组中活细胞数目最多、生长状态最好的，因此，其是体外成纤维细胞培养的最适血清体积分数。而40%血清体积分数组的细胞在后期数量下降剧烈，说明血清浓度过高不适宜成纤维细胞的体外培养。综上所述，培养液中胎牛血清体积分数直接影响到后续以其为供体细胞克隆吕梁黑山羊的试验结果，所以在后续的试验中决定选用10%血清体积分数培养液培养供体细胞。

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