不同甘薯品种茎叶中多糖含量的测定分析

2018-03-03冯俊彦雷欣宇仲伶俐黄世群谭文芳

山西农业科学 2018年2期

赵珊，冯俊彦，李曦，雷欣宇，仲伶俐，周虹，黄世群，罗玲，谭文芳，张聪

（1.四川省农业科学院分析测试中心，四川成都 610066；2.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川成都 610061；3.四川省农业科学院作物研究所，四川成都 610066）

多糖又称多聚糖，是由10个以上结构相同或不同的单糖以糖苷键结合而成的高分子化合物，广泛存在于高等植物、藻类、微生物及动物体内。随着近年来对多糖及其复合物研究的不断深入，其具有的抗肿瘤、消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗衰老、抗凝血、免疫调节等方面的活性功能逐渐被发现[1-5]。

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam.）是我国重要的粮食、饲料、工业原料和生物质能源作物，是世界第七大粮食作物[6]。菜用甘薯是指以甘薯嫩梢或叶柄作为食用部位的一种蔬菜专用型甘薯新品种，其茎尖中富含蛋白质、膳食纤维、多糖、黄酮、多酚类物质、多种维生素以及矿物质，保健功效显著[7]。甘薯多糖目前研究主要集中在多糖的提取、组分分析和生物活性等方面。甘薯多糖是甘薯中重要的活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、调节免疫、降血压等生物活性[8]。

目前，常用的多糖含量测定方法有苯酚-硫酸法[9-14]和蒽酮-硫酸法[15-17]。本试验比较了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法在甘薯茎叶多糖测定中的测定效果，为建立准确、可靠、重现性好的甘薯茎叶多糖含量测定方法提供依据；同时比较了15份菜用甘薯和2份鲜食甘薯材料中叶片、叶柄和茎的多糖含量，旨在为多糖的提取应用和甘薯育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

供试15份菜用甘薯品种和2份鲜食甘薯品种分别由四川省农业科学院作物研究所和四川省农业科学院生物技术核技术研究所提供。材料栽种于2017年4月，采集于2017年7月。具体材料选育和来源信息如表1所示。

葡萄糖（≥98%，sigma），无水乙醇、蒽酮、苯酚、浓硫酸均为国产分析纯。

表1 材料名称及来源信息

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计（UV2550，日本岛津）；超声提取器；水浴锅；电热鼓风干燥箱；十万分之一电子天平；实验室纯水仪。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的提取将新鲜的甘薯地上部分茎叶按叶、叶柄、茎分别取下，在50℃下烘干后粉碎过20 mm筛备用。称取0.50 g样品于50 mL具塞离心管中，用5 mL水浸润样品，再缓慢加入20 mL无水乙醇，同时使用涡旋振荡器混合均匀，置于超声提取器中超声30 min，提取后离心去掉上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇再洗涤一次，用50 mL蒸馏水将上述不溶物转移到250 mL具塞三角瓶中，于沸水浴中提取2 h。之后冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中并用蒸馏水定容。过滤后的滤液为样品测定液。

1.3.2 标准溶液的配制称取0.100 0 g 105℃干燥4 h的葡萄糖于100 mL烧杯中，加水溶解定容至1 000 mL，即配成100 mg/L的标准葡萄糖储备溶液。

1.3.3 苯酚-硫酸法显色反应

1.3.3.1 标准曲线分别吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL标准葡萄糖储备液于10 mL比色管中，用蒸馏水补至1.0 mL。加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，充分混匀后于30℃水浴中反应20 min，在486 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3.2 样品测定吸取0.20 mL样品溶液于10 mL比色管中，用蒸馏水补至1.0 mL。加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，充分混匀后于30℃水浴中反应20 min，在486 nm处测定吸光度。

1.3.4 蒽酮-硫酸法显色反应

1.3.4.1 蒽酮试剂配制称取0.10 g蒽酮，用100 mL 80%浓硫酸溶解，现配现用。

1.3.4.2 标准曲线分别吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL标准葡萄糖储备液于10 mL比色管中，用蒸馏水补至1.0mL。立即加入蒽酮试剂6.0mL，振荡混匀后置于沸水浴中加热15 min，然后迅速置于冰水浴中冷却15 min，在625 nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.3 样品测定吸取0.20 mL样品溶液于10 mL比色管中，用蒸馏水补至1.0 mL。立即加入蒽酮试剂6.0 mL，振荡混匀后置于沸水浴中加热15 min，然后迅速置于冰水浴中冷却15 min，在625 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 甘薯茎叶沸水浴时间的确定

选取甘薯叶在沸水浴时，分别做4组样品，每组3 个平行，4 组沸水浴时间分别为 0.5，1，2，3 h。提取的甘薯叶多糖用苯酚-硫酸法测定平均含量分别为2.23%，2.67%，3.39%和3.30%（图1）。从图1可以看出，沸水浴时间2 h时，甘薯叶多糖的含量最高。

2.2 最大吸收波长的确定

2.2.1 苯酚-硫酸法分别吸取葡萄糖标准溶液和甘薯叶片、叶柄、茎样品溶液各1.0 mL，以1.0 mL蒸馏水作为空白，按照1.3.3的显色方法操作，在400～900 nm区域扫描吸收曲线。从图2可以看出，在苯酚-硫酸法测定葡萄糖和甘薯茎叶多糖的试验中，葡萄糖在486.0 nm波长处有明显的最大吸收峰，甘薯叶片、叶柄、茎的多糖分别在482.0，486.0，485.5 nm波长处有最大吸收峰，其余波段无干扰峰的存在。因此，选取486 nm波长作为苯酚-硫酸法的检测波长。

2.2.2 蒽酮-硫酸法分别吸取葡萄糖标准溶液和甘薯叶片、叶柄、茎样品溶液各1.0 mL，以1.0 mL蒸馏水作为空白，按照1.3.4的显色方法操作，在400～900 nm区域扫描吸收曲线。扫描结果如图3所示。由此可见，在蒽酮-硫酸法测定葡萄糖和甘薯茎叶多糖的试验中，葡萄糖在623.0 nm波长处有明显的最大吸收峰，甘薯叶片、叶柄、茎中多糖分别在621.5，626.5，627.0 nm波长处有最大吸收峰。因此，选取625 nm波长作为蒽酮-硫酸法的检测波长。但此方法葡萄糖和甘薯叶多糖在400～900 nm区域波长变化较多，在507，625 nm附近分别出现了较高的吸收峰。

2.3 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法线性范围、稳定性和精密度试验

苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的标准曲线线性回归方程列于表2，相关系数分别为0.999 7和0.999 1。表明这2种方法葡萄糖在0～100 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

吸取甘薯叶多糖样品溶液0.2 mL，加水补齐至1.0 mL，以1.0 mL蒸馏水作为空白，分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法进行显色反应，在486，625 nm处每隔10 min测定一次吸光度（表3）。由表3可知，在60 min内对2种显色方法的吸光度的变化进行考察。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的相对标准偏差（RSD）分别为0.34%和2.57%，可见苯酚-硫酸法较蒽酮-硫酸法表现更为稳定。

分别平行取6份甘薯叶多糖样品溶液0.2 mL，加水补齐至1.0 mL，以1.0 mL蒸馏水作为空白，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法进行显色反应，分别在486，625 nm处测定吸光度值，RSD分别为0.96%，2.93%（表 2）。

表2 方法的线性关系及精密度试验

表3 方法的稳定性试验

2.4 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法回收率试验

精密移取甘薯叶片、叶柄和茎的样品溶液12份，分成4组装于比色管中，每组分别加入100mg/L的葡萄糖标准溶液 0.00，0.20，0.40，0.60mL。采用苯酚 -硫酸法和蒽酮-硫酸法测定其吸光度，分别计算其加标回收率，结果如表4所示。苯酚-硫酸法回收率在87.3%～103.1%，RSD在0.08%～1.73%。蒽酮-硫酸法回收率在87.4%～101.2%，RSD在0.81%～3.59%。回收率试验结果表明，这2个方法均可用于甘薯叶、叶柄和茎多糖含量的测定。

表4 苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法加标回收率（n＝3）

2.5 样品的测定

分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法对17份甘薯材料的叶片、叶柄和茎中多糖含量进行测定，每个样品平行测定3次，测定结果如表5所示。

苯酚-硫酸法的测定结果表明，17份甘薯叶片多糖的含量为3.00%～4.84%；叶柄多糖的含量为2.34%～4.21%；茎多糖的含量为1.98%～3.63%；其中含量相对最高的材料是坦桑尼亚。蒽酮-硫酸法的测定结果显示，17份甘薯叶片多糖的含量为1.11%～2.52%；叶柄多糖的含量为1.37%～2.85%；茎多糖的含量为1.26%～2.69%；其中含量相对最高的材料是泉薯830。

通过比较2种显色方法测定结果发现（表5），苯酚-硫酸法测定甘薯叶片、叶柄和茎中多糖含量普遍高于蒽酮-硫酸法，其中叶片的差异最大。苯酚-硫酸法的测定结果表明，叶片多糖的含量高于叶柄和茎。蒽酮-硫酸法结果表明，叶柄和茎的含量高于叶片。在最大吸收波长扫描的结果中发现，蒽酮-硫酸法在507，625 nm附近分别出现了较高的吸收峰，特别是甘薯叶片在507 nm附近的吸收峰还高于621.5 nm的吸收峰，甘薯叶柄和茎在507，625 nm附近有相近强度的吸收峰。而苯酚-硫酸法只在486 nm波长附近处有最大吸收峰，其余波段无干扰峰的存在，说明甘薯多糖在苯酚-硫酸作用下生成衍生物组分比较单一，显色效果好。这有可能是在甘薯叶片多糖含量的测定结果中蒽酮-硫酸法远低于苯酚-硫酸法的一部分原因。另外，在稳定性、精密度以及回收率试验上蒽酮-硫酸法的RSD均高于苯酚-硫酸法。因此，认为苯酚-硫酸法在稳定性和准确性上均优于蒽酮-硫酸法。

表5 甘薯叶片、叶柄和茎中多糖的含量

罗霞等[18]采用蒽酮-硫酸法测定甘薯藤蔓多糖的范围为2.63%～5.95%。王宪昌等[19]研究发现，甘薯生长期茎蔓和成熟期茎蔓的多糖含量分别为5.33%和4.22%。丁文等[20]采用蒽酮-硫酸法研究发现，甘薯嫩茎、老茎和叶中多糖含量分别为6.12%，4.47%和2.09%。本试验采用蒽酮-硫酸法测定甘薯叶、叶柄和茎的结果为1.11%～2.85%，结果比之前的研究偏低，其原因可能与试验材料不同有关；此外，王宪昌等[19]、丁文等[20]都是测定初步提纯后的甘薯多糖，有可能直接提取测定杂质对显色有干扰，所以，与纯化后测定甘薯多糖结果有一定的差异。因此，推测蒽酮-硫酸法测定甘薯茎叶多糖更适用于提纯去除杂质后的样品。

3 结论

本研究优化了甘薯茎叶多糖的提取方法，比较了苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法对甘薯多糖的测定结果。通过比较沸水浴时间与多糖含量测定的关系，确定了最优沸水浴时间为2 h。采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法这2种显色方法对甘薯叶片、叶柄和茎多糖的含量测定进行了比较，在最大吸收波长扫描、线性关系的考察、稳定性试验、精密度试验以及回收率试验上进行比较。确定苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法的检测波长分别为486，625 nm，表明苯酚-硫酸法在稳定性和准确性上均优于蒽酮-硫酸法。

通过与前人的研究结果进行比较分析发现，本研究采用蒽酮-硫酸法测定甘薯茎叶多糖的结果比之前的研究结果偏低，原因可能与材料差异以及在显色过程中杂质的干扰有关。本研究推测蒽酮-硫酸法测定甘薯茎叶多糖更适用于提纯去除杂质后的样品。

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