田耕晨，曾文涛

(1.绍兴市高级中学，浙江 绍兴 312000； 2.绍兴文理学院，浙江 绍兴 312000)

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞外膜的组分，作为一种免疫激活剂，常用于免疫学研究和临床医学中，其在新兴的无脊椎动物免疫学研究方面应用较少。已有研究表明，脂多糖对栉孔扇贝血清和血细胞中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的活力有激活加强作用[1]，并可显著增强栉孔扇贝血细胞的吞噬活力[2]。但上述研究仅限于部分海产贝类，有关三角帆蚌ACP、AKP的相关报道较为少见[3-4]，尤其是LPS对其活力的影响罕见报道。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国特有的淡水育珠蚌，但不当的植珠手术、不良的水体环境和对河蚌进行高密度吊养及不当的施肥导致水体富营养化都会导致三角帆蚌抵抗力下降、感染细菌等疾病[5-6]。本研究以三角帆蚌为试验材料，注射LPS后，于不同时间测定其血清中ACP、AKP的活力，以探讨LPS对三角帆蚌血清中2种水解酶活力影响及其规律，从而为探讨LPS作为免疫激活剂应用于淡水育珠蚌的免疫学研究和疾病预防提供一定的基础资料。

1 材料与方法

1.1 三角帆蚌与LPS诱导刺激

三角帆蚌购自诸暨某珍珠养殖场，平均体重约100 g，在经曝气的水族箱(5 m×3 m×2 m)中暂养7 d(22±2)℃。每只蚌于闭壳肌中注射50 μg LPS进行诱导刺激(Sigma公司产品，浓度1 μg·μL-1)，试验组注射等量生理盐水，设3个平行。

1.2 血清的准备

诱导刺激后6、12、24、48、72和96 h，分别用注射器从闭壳肌中抽取血淋巴，于4 ℃ 3 000g下离心10 min，取上清用于ACP、ALP酶活力的测定。

1.3 酶活力的测定

根据南京建成生物工程研究所的ACP、AKP酶活测定试剂盒说明书，进行三角帆蚌血清上ACP和AKP活力的测定。用Excel软件进行数据处理与统计，t检验显著性差异。

2 结果与分析

2.1 LPS诱导刺激对三角帆蚌ACP活力的影响

在LPS诱导刺激后，分别于6、12、24、48、72和96 h测定三角帆蚌血清中ACP的活力，具体结果如图1所示。自LPS诱导刺激6 h起ACP活性快速增强(为对照组的2倍以上)，至48 h达到峰值(近2.8倍)，随后又逐渐下降；96 h时，ACP活力基本与6 h时相近。同时在试验期间所有时间段内(6～96 h)，试验组的ACP活力均显著高于对照组(P<0.05)，其中48 h时极显著高于对照组(P<0.01)。表明LPS诱导刺激对ACP活力具激活增强作用。

图1 LPS诱导刺激对ACP活力的影响

2.2 LPS诱导刺激对三角帆蚌AKP活力的影响

在LPS诱导刺激后，分别于6、12、24、48、72和96 h测定三角帆蚌血清中AKP活力，具体结果如图2所示。自LPS诱导刺激6 h起AKP活性逐渐增强，至48 h达到峰值(为对照组的2.65倍以上)，随后又逐渐下降；96 h时，AKP活性略高于对照组；12～72 h时，试验组的AKP活力均显著高于对照组，其中48 h时极显著高于对照组(P<0.01)。表明与ACP相似，LPS诱导刺激对AKP活力也具有较强激活增强作用。

图2 LPS诱导刺激对AKP活力的影响

3 讨论

有关软体动物免疫机制的研究受到国内外关注[7-10]。已有研究表明，在缺乏特异性免疫球蛋白的软体动物体内，水解酶在清除异物的过程中发挥了重要作用[10-12]，参与病原微生物、寄生虫和肿瘤的杀灭和清除等过程。

ACP是溶酶体的标志酶。在酸性环境下，酸性磷酸酶能够通过水解作用将表面带有磷酸酯的异物破坏掉，从而达到预防感染的目的，并可修饰或改变外来异物的表面分子组成，从而增强血细胞对异物的识别，起到调理的作用，加快吞噬细胞对异物的吞噬和降解速度[13]。同ACP一样，AKP也是软体动物溶酶体酶的重要组分，在免疫反应、调节体内的钙磷代谢和角蛋白分泌，以及软体动物贝壳的形成等生物学过程中发挥重要作用[14-15]。

本研究结果显示，在LPS诱导刺激6 h后，三角帆蚌血清中ACP和AKP的活力均逐渐增强，并均与48 h达到峰值，随后下降，呈明显先升后降的趋势，表明与其他贝类中的研究结果类似，LPS诱导刺激，对三角帆蚌血清中的ACP、AKP活力有激活加强作用，也证明这两种水解酶对贝类天然免疫反应过程具有重要作用。但LPS刺激后，三角帆蚌血清中2种酶活力的变化稍有差异，ACP活力在试验期间所有时间段内(6～96 h)，试验组均显著高于对照组；而AKP活力在12～72 h时，试验组的AKP活力均显著高于对照组。总之，本研究明确了LPS诱导刺激对三角帆蚌血清中ACP和AKP 2种水解酶活力的刺激增强作用。

[1] 徐翊轩，战文斌，邢婧. 温度与脂多糖对栉孔扇贝血细胞吞噬活力的影响[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版)，2015，45(6):31-38.

[2] 孙虎山，李光友.脂多糖对栉孔扇贝血清和血细胞中7种酶活力的影响[J]. 海洋科学，1998，4:54-57.

[3] 万谦，张洪渊. 3种淡水育珠蚌碱性磷酸酶(ALP)比较酶学的初步研究[J]. 四川大学学报(自然科学版)，1994，31(2):264-268.

[4] 施志仪，李勇，谢先中. 三角帆蚌外套膜碱性磷酸酶与钙代谢的关系[J]. 上海水产大学学报，2008，17(3)：291-297.

[5] 王晓玲. 人工育珠的淡水“三蚌”简介[J]. 生物学教学，1997(8):37-38.

[6] 钱伟平，沈文英，张兴娣. 三角帆蚌病害原因及其防治技术[J]. 经济动物学报，2001，5(4):36-39.

[7] TRIPP M R.Defense Mechanisms of mollusks [J].J Reticuloendothel Soc，1970，7(1):73-182.

[8] LOKER E S，ADEMA C M，ZHANG S M， et al. Invertebrate immune systems not homogeneous，not simple，not well understood[J]. Immunol Rev，2004，(198): 10-24.

[9] GOMES N G M，DASARI R，CHANDRA S，et al. Marine invertebrate metabolites with anticancer activities: solutions to the “Supply problem”[J]. Mar Drugs，2016，14(5)：98-105.

[10] 吴宁，陈梦玫，王素芳. 贝类免疫机制的研究进展[J]. 药物生物技术，2017，24(1)：68-71.

[11] 刘志鸿，牟海津，王清印. 软体动物免疫相关酶研究进展[J].海洋水产研究，2003，24(3)：86-90.

[12] PIPE R K.Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the marine musselMytilusedulis[J]. Histochemical Journal，1990，22:595-603.

[13] CHENG I C. The role of lysosmal hydrolases in molluscan cellar response to immunologic challenge[J].Comp Pathbiol，1978，4:59-71.

[14] 谢莉萍，林静瑜. 合浦珠母贝碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究[J]. 海洋科学，2000，24(10)：37-40.

[15] 牟海津，江晓路，刘树青，等. 免疫多糖对栉孔扇贝酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J].青岛海洋大学学报，1999，29(3):463-468.