佘银，罗芳，高婉茹，李鑫，刘霞

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410000）

乳酸菌具有改善肠道菌群结构、增强机体免疫力和缓解乳糖不耐症等重要生理功效，可以防治肥胖、“三高”、糖尿病和精神方面等疾病[1-2]。随着人年龄的增长和当人体处于非健康状态时，肠道中乳酸菌的数量都会逐渐减少。乳酸菌在人体胃肠道的粘附数量及其活性是影响人体健康的重要因素之一。因此，增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要，而乳酸菌对胃肠粘膜的粘附作用是其定植及增生的首要条件[3]。明确益生菌的粘附机理对于制备益生菌制剂和更好地认识微生态学基本规律都有十分重要的意义。目前，随着探究乳酸菌粘附的新方法一直涌现，学者们对乳酸菌粘附素以及肠道粘液层相关受体有了进一步的深入了解。同时发现，乳酸菌的粘附过程也受到诸多要素的影响，如生长阶段、pH值、酶、氯化锂等。本文总结了关于乳酸菌粘附特性的研究方法、粘附机理和及其影响因素3个方面的研究现状，并对它们之后的研究前景做了一定的展望分析。

1 乳酸菌粘附特性的研究方法

评价乳酸菌粘附能力的研究方法有直接法和间接法。直接法即采用平板、染色等方法对直接粘附在肠上皮细胞或粘液上的乳酸菌计数；间接法即先利用抗体、放射性同位素、荧光素等物质标记乳酸菌，后再与细胞或肠粘液共育，从而计算该菌的粘附率。目前，一些新的实验技术，如表面等离子体共振研究技术、计算机分子模拟法等被应用到分析乳酸菌粘附作用的研究当中，帮助研究者们进一步明确乳酸菌的粘附机理。

1.1 平板法、染色法、分光光度法

平板法是研究乳酸菌粘附作用的最原始方法，粘附在肠上皮细胞或肠粘液上的乳酸菌被释放之后，进行平板计数，直接得到粘附的乳酸菌数量。此方法简单，但重现性较差[4]；染色法即革兰氏染色之后，通过计数一定细胞上的乳酸菌数可得到单个细胞被粘附的乳酸菌数量。此法较简单，但是工作量也大，且存在一定的系统误差[5]。分光光度法是通过粘附前后吸光值的变化来评价乳酸菌的粘附能力。此法对试验设备的要求较低，但需要乳酸菌数量足够多，粘附能力较强，否则会影响其灵敏度，并且无法区分活菌与死菌[6]。

1.2 放射性同位素标记技术

放射性同位素标记法指将15N、3H、35S、32P、18O等放射性元素作为追踪剂，对研究对象进行标记的分析方法。Gueimonde等[7]将乳酸菌接入含有一定放射性的液体培养基中，培养、离心、冲洗，再用缓冲液制成菌液。之后添加到已经固定有肠上皮细胞或肠粘液的培养板内，培育、冲洗，通过其放射性评价乳酸菌粘附能力。此方法对设备要求高，且试验过程要接触放射性物质，对人体有害。

1.3 荧光标记技术

荧光标记法指将荧光素以共价结合或物理吸附的方式连接到研究对象的目的基团上，然后通过其荧光特性来反应被研究对象的某些信息。Das等[8]用羧基荧光素琥珀酰基胺酯（cFDA-SE）标记菌株，已标记的菌株与HT-29 MTX细胞共育后用无菌PBS缓冲液冲洗未粘附的菌株，在荧光显微镜下观察得到嗜酸乳杆菌NCFM的粘附能力较植物乳杆菌WCFS1、短乳杆菌ATCC367和发酵乳杆菌BR11更强。也可以测定粘附前后荧光物质的发光强度来评价乳酸菌对细胞的粘附能力。该法操作较复杂，对试验设备要求较高，乳酸菌的表面性质会受到影响。此外，随着时间的延长，荧光物质的发光性能会慢慢减弱，所以在实际应用中也较少。

1.4 显微镜研究技术

透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种具备高分辨率的电子光学仪器。Polakberecka等[9]通过TEM可明显观察到鼠李糖乳杆菌E/N具有纤维状的胞外多糖，而鼠李糖乳杆菌PEN不具有胞外多糖，并比较了两者的粘附能力，结果表明具有胞外多糖的菌株粘附能力更强。

扫描电镜（Scanning Electronic Microscopy，SEM）指介于透射电镜和光学显微镜间的可以观察到研究对象微观性貌的一种观察手段。Vesterlund等[10]首次采用了共聚焦扫描电镜技术对肠道细菌进行了实时三维观察，此法解决了在多种菌同时存在的情况下也同样适用的问题。

原子力学显微镜（Atomic Force Microscope，AFM）是通过原子、分子间的相互作用力来观察物质表面的形貌，即而可得到其待测样品的表面情况相关信息[11]。Tripathi等[12]利用AFM研究了鼠李糖乳杆菌GG与粘蛋白的相互作用，从构建三维立体的结构中直接以力的形式观察研究物质间的作用。此法对样品处理的要求简单，无需导电，可在多种环境下工作。因此，AFM在乳酸菌的粘附机理研究方面有着良好的应用前景。

1.5 基于免疫学的粘附实验技术

在对乳酸菌表面蛋白进行粘附性实验中，Western Blot杂交技术被多次应用。Zhang B等[13]应用Western Blot技术对植物乳杆菌NL42细胞表面的细胞壁固定蛋白进行了检测，确定了细胞壁固定蛋白在该菌的粘附作用中起到了作用。该方法可能会导致交叉感染，在实际应用中，由于高质量的单克隆抗体往往很难获得，价格高，所以该方法的发展也受到了一定的限制。

1.6 表面等离子体共振研究技术

表面等离子体共振技术（Surface Plasmon Resonance，SPR）是从20世纪90年代发展起来的一种基于物理光学原理的新型分析系统。运用SPR技术，可以直接的观测到菌体粘附性的情况，得到相互作用的结合常数，且对样品的需求量小，样品处理简单、检测灵敏度高。但是，目前这种方法运用的并不是很普遍，但该方法可为人们研究乳酸菌的粘附机制提供新的途径。

Uchida等[14]第一次利用SPR技术对嗜酸乳杆菌与人体结肠粘液的粘附性进行了研究，并通过此方法筛选得到粘附能力较强的菌株。Leeuw E D等[15]利用SPR技术对短乳杆菌ATCC8287的S-层蛋白与细胞外基质蛋白的粘附性进行了研究，结果显示SlpA与粘蛋白和层粘连蛋白具有较强的粘附能力。Nakamata K等[16]利用SPR技术对鼠李糖乳杆菌上粘蛋白与猪结肠粘液、层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白四型的粘附性进行了研究，结果表明突变型菌株的粘附能力较野生型菌株弱。

1.7 计算机分子模拟法

计算机分子模拟法是计算机在科研工作中被不断应用而发展起来的一门新的科学研究方法，通过计算机软件以原子水平的模型来模拟研究对象的结构和行为，从而进一步模拟物质的各种理化性质。该方法可以分析分子间结合过程的相关分子构象、静电势能、疏水性等物理性质，找到底物与受体的最佳结合位点和作用力类型[17]。Das等[8]利用蛋白质-蛋白质对接软件（Hex ver 6.0）对4种乳杆菌细胞表面的粘蛋白与肠粘蛋白的三维空间结构对接情况进行了分析，筛选出了对肠粘蛋白具有最高粘附能力菌株。

2 乳酸菌的粘附机理

乳酸菌的粘附能力是评价其作为益生菌的重要标准之一[3]。粘附能力弱的乳酸菌进入人体之后会随着肠道的蠕动不断地被排出体外，而高粘附能力的乳酸菌在肠道可以停留较长时间，甚至在肠道内得以生存和繁殖，继而充分发挥其功能[18]。目前，研究一致认为乳酸菌的粘附过程首先是可逆的非特异性粘附阶段，之后，乳酸菌粘附进入到特异性粘附阶段，该阶段主要是由乳酸菌表面粘附素与肠上皮细胞或肠粘液中的粘附受体进行特异性的结合的过程。

2.1 乳酸菌的非特异性粘附阶段

乳酸菌的非特异性粘附过程跟复杂的物理化学作用密切相关，大量研究表明乳酸菌的表面性质对乳酸菌的粘附具有重要作用，尤其是与其表面电荷，疏水作用，自聚合能力等具有密切联系[19]。B.kos等[20]研究证明，自聚集能力对嗜酸乳杆菌M92与猪肠上皮细胞的粘附作用有一定的促进作用。龚虹等[21]通过研究比较产品中5株益生菌生物膜形成能力、自凝集能力和疏水能力，通过实验发现三者呈正相关，均可作为考察菌株粘附能力的指标。然而，García-Cayuela T等[22]探讨了植物乳杆菌的自聚集能力、共聚集能力和菌株表面疏水性质三者之间的相互联系，结果表明自聚集能力强的菌株共聚集能力更强，而与疏水性和粘附能力没有表现出一定的相关性。可见，乳酸菌的粘附能力受诸多因素的影响，其细胞表面特性与粘附之间的关系还值得我们进行深入研究。

2.2 乳酸菌的特异性粘附阶段

乳酸菌进行非特异性粘附之后，进入乳酸菌粘附素与宿主肠道上皮细胞或肠粘液相应受体间的特异性粘附阶段[23]。粘附素主要是乳酸菌表面一些蛋白质，多糖、脂磷壁酸等多样化分子，图1是乳酸菌表面分子结构示意图。宿主胃肠道粘液层的相关蛋白和糖脂可能是粘附受体，目前对细胞外基质的研究也越来越多。表1是近年来国内外关于粘附素和粘附受体的研究结果。

图1 乳酸菌细胞表面结构示意图Fig.1 Cell-surface architecture of Lactobacillus

表1 乳酸菌的有关粘附素和粘附对象Table 1 Adhesins and adhesion matrix of some Lactobacillus

续表1 乳酸菌的有关粘附素和粘附对象Continue table 1 Adhesins and adhesion matrix of some Lactobacillus

2.2.1 粘附素

粘附素是细菌表面具有粘附能力的一些相关蛋白质和特殊结构的统称，可存在于细菌的菌毛、细胞壁、外膜蛋白、荚膜等结构，其化学本质是特定的蛋白质、多肽、糖脂和糖类等具有多结构的多功能化分子[23]。粘附素的重要来源主要是乳酸菌细胞表面的脂磷壁酸、完整肽聚糖、多糖和表面蛋白等物质，这些成分可能直接或间接地参与了乳酸菌的粘附过程[11]。

2.2.1.1 表面蛋白

在乳酸菌中，表面蛋白是目前研究最多的一类粘附素。它的结构为方形或六边形对称，且呈单分子晶体排列，相对分子质量在40 kDa~200 kDa之间。1993年，Heinj等[24]第一次从嗜酸乳杆菌ATCC4356中提取了表层蛋白。目前，大量乳杆菌中的表面蛋白都已被进行了深入的研究探索，如短乳杆菌ATCC8287的表层蛋白 A（SlpA）[15]、瑞特乳杆菌的粘液结合蛋白（Mub）[25]和粘附促进蛋白（MapA）[26]、卷曲乳杆菌的胶原结合表层蛋白（CbsA）[27]、植物乳杆菌NL42的细胞壁固定蛋白（CwaA）[13]等。其中有的已得到其基因序列，将表面蛋白基因重组到不具备粘附的益生菌基因组中是非常值得研究的一个新思路。其中，L.acidophilus ATCC 4356、L.Acidophilus NCFM、L.crispatus JCM 5810都含有SlpA、SlpB两个表层蛋白编码基因[27]，并且L.Acidophilus NCFM还含有SlpX表层蛋白编码基因[28]，L.brevis ATCC 14869含有 SlpB、SlpC、SlpD 3个编码表层蛋白的基因，具有亲缘性的菌株的表层蛋白的编码基因序列具有相似性[29-30]。

2.2.1.2 胞外多糖

乳酸菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是乳酸菌在生长代谢过程中，分泌到细胞壁外，常渗于培养基的一类糖类化合物，它们都是乳酸菌为适应环境的产物[31]。在细胞外层，乳酸菌胞外多糖和含有肽链取代基的多糖可以形成一种多糖外层，这种多糖外层具有粘附性，可与肠道粘液层进行接触，进而对肠道起到粘附作用[32]。另外，多糖被肠道菌群降解后产生的丁酸盐，可以维持肠道粘膜的完整性。Polakberecka等[9]通过TEM可明显观察到L.rhamnosus E/N具有纤维状的胞外多糖，而L.Rhamnosus PEN不具有胞外多糖，并比较了两者的粘附能力，结果表明具有胞外多糖的菌株粘附能力更强。

2.2.1.3 肽聚糖

肽聚糖（Peptidoglycan，PG）是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成的一类多层网状大分子结构。目前，关于乳酸菌细胞壁中肽聚糖作为粘附素的研究非常少，而多集中在双歧杆菌细胞壁肽聚糖方面。邓一平等[33]研究双歧杆菌的脂磷壁酸、完整肽聚糖、多糖对猪胃粘膜糖蛋白的粘附作用。结果表明，三者均参与了乳酸菌的粘附过程。

2.2.1.4 脂磷壁酸

脂磷壁酸（Lipoteichoic Acid，LTA）是革兰氏阳性菌的特征性膜结合聚合物，是组成细胞壁的重要成分[34]。Weidenmaier C等[35]将构建了金黄色葡萄球磷壁酸合成缺陷型的tagO基因突变体，对大鼠的鼻腔粘膜上皮细胞进行粘附，结果发现该菌体的粘附率降低了90%。Walter J等[36]对罗伊氏乳杆菌研究发现，脂磷壁酸丙氨酸残基的缺失，显著影响了罗伊氏乳杆菌在小鼠胃肠道中生物膜的形成能力。以上研究表明，脂磷壁酸在细菌粘附过程中具有重要意义。

2.2.2 粘附受体

除了乳酸菌细胞表面需要有粘附素外，宿主胃肠道是否含有相应的受体，决定了乳酸菌是否能够在宿主胃肠道内有较好的粘附和定植[23]。粘蛋白是胃肠道粘液中最常见的结构成分，其次是脂质、酶和核酸的复杂混合物。迄今为止，在人类中发现了大约20种不同的粘液编码基因，并且在其他动物物种中也发现了一些同源muc基因，在分泌的粘蛋白中，主要有MUC2、MUC5AC、MUC5B 和 MUC6，其中 MUC2是胃肠道中最主要的粘液成分[37]。因为水的重量占了胃肠道粘液的95%，所以观察粘液层的具体形态是很有挑战的。Johansson F等[38]利用16rRNA探针进行原位杂交，发现细菌在外部的粘液层进行了大批繁殖，但是却不能穿过与上皮细胞相邻的内粘液层，而上皮细胞是由紧密相连的粘液细胞组成的。因此，内粘液层在防止病原菌接触和入侵上皮细胞的过程中扮演着重要角色。目前，研究乳酸菌对肠上皮细胞、肠粘液和细胞外基质蛋白粘附作用的成果越来越多。其中细胞外基质蛋白研究较多的包括包括胶原蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白和纤维蛋白等。

3 影响乳酸菌粘附作用的因素

乳酸菌的粘附作用是其菌体细胞表面的粘附素与胃肠道粘液中的受体共同作用完成的，同时，乳酸菌的理化性质以及外部环境也会影响其粘附能力，如菌体生长阶段、菌液浓度、pH值、蛋白酶、离子浓度等。为了使乳酸菌在体内发挥更好的粘附效果，创造适宜的环境更有利于乳酸菌的粘附和定植。

3.1 生长阶段、菌液浓度

在乳酸菌生长的不同阶段，其形态结构、活性、代谢产物等都会有一定的差异，大量研究表明，大多数乳酸菌生长到稳定期的粘附性大于其他三个时期[49-50]。一般情况下，随着菌悬液浓度的增大，乳酸菌粘附能力也随之增大，当达到一定浓度时，乳酸菌粘附量趋于稳定。陈军等[49]研究了青春型双歧杆菌0926对大鼠肠上皮细胞的粘附能力，结果显示，该菌的粘附能力随着菌悬液浓度的增加而明显增加，呈现S形关系，在菌液浓度为108CFU/mL～109CFU/mL时，粘附基本趋于饱和。

3.2 pH值

陈臣[51]研究发现植物乳杆菌ST-Ⅲ在pH为7时，与Caco-2细胞的粘附能力最强。Yadav等[45]研究了pH对植物乳杆菌Lp5276、Lp91与胶原蛋白相互作用的影响，结果表明在pH为6时，植物乳杆菌Lp5276、Lp91与胶原蛋白具有较高粘附能力。针对不同种类的菌株，pH对它们粘附能力的影响是不同的。总体而言，在中性或偏酸性条件下有利于乳酸菌的粘附。

3.3 酶

Yadav等[45]研究发现植物乳杆菌（Lp9、Lp5276、Lp71、Lp72、Lp91）在胰蛋白酶、胃蛋白酶的作用下，粘附纤连蛋白、胶原蛋白的能力下降约50%。在溶菌酶的作用下，其粘附能力更是下降了65%~70%。Bo Zhang等[13]研究了在不同浓度胰蛋白酶的作用下，植物乳杆菌NL42粘附HT-29细胞的能力随着胰蛋白酶浓度的增加而降低，当胰蛋白酶的浓度达到30 mg/mL时，其粘附能力下降了约80%。研究结果进一步说明了乳酸菌表面的蛋白类物质在乳酸菌的粘附过程中起到了重要的作用。

3.4 氯化锂、高碘酸钠

Polakberecka等[9]研究发现，鼠李糖乳杆菌（PEN、E/N）在LiCl的影响下，自聚集能力明显下降。赵维俊[50]研究发现随着LiCl浓度的提高，乳杆菌表面疏水能力随之逐渐减弱。乳酸菌细胞表面蛋白在LiCl的作用下被破坏，说明了蛋白类物质在乳酸菌的自聚集能力、疏水性作用中起到了重要作用，而乳酸菌的疏水能力和自聚集能力又是衡量其粘附能力的重要标志。Bo Zhang等[13]研究了高碘酸钠对植物乳杆菌NL42粘附HT-29细胞的影响，结果表明，高碘酸钠对植物乳杆菌NL42粘附HT-29细胞的影响不显著。高碘酸钠具有氧化菌体细胞表面碳水化合物的作用，从侧面说明碳水化合物不是影响植物乳杆菌NL4粘附能力的最关键成分。

4 展望

目前，尽管对乳酸菌粘附机理已经做了很多研究工作，但主要集中在乳酸菌粘附素上，对肠道粘液层受体的研究还需要进一步探索；其次，关于乳酸菌粘附素，表面蛋白的研究比较全面，在今后的研究中，对各蛋白进行全基因组测序和基因组学分析对深入了解乳酸菌粘附机制有重要意义；并且，将粘附相关蛋白基因重组到不具备粘附的益生菌基因组中是非常值得研究的一个新思路，使不具备粘附能力或粘附能力低的乳酸菌在宿主体内更好的发挥益生功能；另外，脂磷壁酸、胞外多糖和肽聚糖等粘附素是如何参与乳酸菌粘附作用，其作用机制还需更深入的研究；最后，由于乳酸菌制剂种类越来越多，激素、抗生素、各种添加剂、细菌毒素等是否会影响乳酸菌的粘附定植。严格控制影响乳酸菌粘附的因素，使乳酸菌在胃肠道粘液中发挥最大功效，对人体健康具有重要意义。

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