邢新锋　叶强

【摘 要】目的：建立测定绿咖啡豆提取物中绿原酸的HPLC方法，测定和比较不同绿咖啡豆提取物绿原酸的含量。方法：采用十八烷基键合硅胶填充柱（C18（2），100A，4.6×250mm，5?m）；以乙腈-水-甲酸（250：750：1，v/v/v）为流动相A，以乙腈-水-甲酸（100：900：1，v/v/v）为流动相B，梯度洗脱为0～20min，0～100%A，100～0%B；20–30min，100%A，0%B；30～32min，100～0%A，0～100%B；32～40min，0%A，100%B，体积流量为1.5mL/min；柱温25℃；检测波长为330nm；进样量10μL。结果：绿原酸在0.02～0.20μg呈线性良好关系；其平均回收率（n=18）为99.73%。结论：该法简便，重复性好，可用于绿咖啡豆提取物中绿原酸成分的含量测定。

【关键词】绿咖啡豆提取物；绿原酸

Abstract：Objective To establish an HPLC method for determination chlorogenic acid from Green coffee been extract，determinate and compare the contents of chlorogenic acid from different Green coffee been extract. Methods： The HPLC system consisted of a C18 （4.6×250 mm，5 ?m），the mobile phase A was acetonitrile-water-formic acid（250：750：1，v/v/v），the mobile phase B was acetonitrile-water-formic acid（100：900：1，v/v/v）.The gradient elution condinations： 0～20 min，0～100%A，100～0%B，20 – 30 min，100%A，0%B，30～32 min，100～0%A ，0～100%B，32～40 min，0%A，100%B，The flow rate was 1.5 mL/min and the column temperature was 25 ，The detection wavelength was 330 nm and the injection volume was 10 μl. Results： The calibration curves of chlorogenic acid had good linear relationship in the ranges of 0.02～0.20 μg，And the average recoveries （n=18） of chlorogenic acid was 99.73%，respectively. Conclusion： This method can be applied to determinating the components from Green coffee been extract.

Key words： Green coffee been extract；chlorogenic acid

【中圖分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2018）23-0-01

绿咖啡豆提取物（Green coffee been extract）是以咖啡树Coffea arabica L.或罗布斯塔Coffee robusta L.成熟的种子去壳后经水或一定比例的乙醇水溶液提取分离制成的植物提取物，其中有效成分主要为绿原酸，具有降压、抗肿瘤、补肾、抗氧化等作用，也可用作保健食品中，使保健食品香甜可口味道好。目前天然植提行业中已了解的绿原酸成分有3-咖啡酰奎尼酸（3-CQA）， 5-咖啡酰奎尼酸（5-CQA）， 4-咖啡酰奎尼酸（4-CQA）， 5-阿魏酰奎尼酸， （5-FQA）， 3，4-二咖啡酰奎尼酸（3，4-diCQA）， 3，5-二咖啡酰奎尼酸 （3，5-diCQA）， 和4，5-二咖啡酰奎尼酸 （4，5-diCQA）。虽已有不少绿原酸成分的研究，但对绿原酸含量的测定却未见文献报道。故本研究建立了HPLC法测定现在市场中主要的绿咖啡豆提取物中绿原酸的含量的方法，为绿咖啡豆提取物的质量评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-15C高效液相色谱仪；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；HWS24电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；AE240电子天平（梅特勒-托利多）。UV-1800紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）。

1.2 试药 样品由浙江天草生物科技有限公司生产提供的样品（批号：20161001、20161002、20161003）以及多种市售产品的样品组成。具体样品信息见表1。对照品由浙江天草生物科技有限公司生产提供（批号：20160801） 含量：98.5%。水为娃哈哈纯净水（娃哈哈集团有限公司），甲酸（色谱级），乙腈（色谱级）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用十八烷基键合硅胶填充柱（C18（2），100A，4.6250mm，5?m）；以乙腈-水-甲酸（250：750：1，v/v/v）为流动相A，以乙腈-水-甲酸（100：900：1，v/v/v）为流动相B，按表2中的要求进行梯度洗脱；柱温25℃；检测波长为330nm；流速为1.5mL/min；进样量10μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于10000。

对照品特征图谱中呈现7个特征峰，其中与绿原酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±5%之内。规定值为：0.66（3-咖啡酰奎尼酸/3-CQA），1.00（绿原酸），1.06（4-咖啡酰奎尼酸/4-CQA），1.53（5-阿魏酰奎尼酸/5-FQA），2.27（3，4-二咖啡酰奎尼酸/3，4-diCQA），2.39（3，5-二咖啡酰奎尼酸/3，5-diCQA），2.55（4，5-二咖啡酰奎尼酸/4，5-diCQA）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品10mg于10mL量瓶中，加60%甲醇溶液8ml，超声使溶解，放冷，用60%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取5mL至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取各样品25mg，置50mL量瓶中，加60%甲醇溶液40mL，超声使溶解，放冷，用60%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 精密吸取绿原酸对照品溶液适量，加流动相溶解并稀释，分别精密制成浓度为0.02 mg/mL、0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL和0.20mg/mL的溶液，摇匀，分别精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品的浓度（c）为横坐标，绿原酸面积（A）为纵坐标，计算线性回归方程，并绘制标准曲线，结果见表3。

2.4 定量限和检测限 按照“2.1”项下色谱条件，采用对照品溶液稀释，进样测定。分别以3倍和10倍标准偏差对应的浓度值为测定方法的检出限和定量限。结果见表4。

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，根据主峰峰面积计算进样精密度，结果见表5。

进样精密度試验结果说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取样品1（批号20161001）6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，测定6份样品的含量，计算精密度，结果见表6。

2.7 稳定性试验 取样品1（批号20161001）粗粉适量，在同一实验室里，在不同的时间内，由不同的实验者，在不同的仪器上，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，得实验的稳定性，结果见表7。

结果表明实验结果稳定。

2.8 加样回收率试验 取已测定含量的绿咖啡豆提取物样品1（批号：20161001）共18份，每份精密称量，称量的结果如下表，配制80%、100%、120%三个浓度的供试品溶液各六份，按照“2.1”项下色谱条件分析，按外标法以峰面积计算，结果见表8。

2.9 样品的测定 取样品1～10适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含100μg的溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取绿原酸对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得，结果见表9。

测定结果显示目前绿咖啡豆提取物主要产品中绿原酸含量都在20%以上，总绿原酸都在40%以上，可以以此作为绿咖啡豆提取物的质量评价标准。

3 讨论

本实验采用HPLC法测定绿咖啡豆提取物中主要有效成分绿原酸的含量，方法简便，重复性好，可用于快速测定绿咖啡豆提取物中绿原酸的含量，为绿咖啡豆提取物的质量评价提供了新的科学参考依据。