◎ 许再元

（中国广州分析测试中心，广东 广州 510070）

双歧杆菌是一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，由于其对人体有诸多好处，如预防腹泻，减少便秘，抗过敏、抗肿瘤、调整肠道功能及改善营养等，常作为一类体外摄入的活性菌添加到许多不同的食品中。对于双歧杆菌的分离与鉴定方面的研究也随着其作用的不断发现得到了应有的重视和发展。从1899年法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出双歧杆菌开始，双歧杆菌已发现有32个亚型[1]。其鉴定的手段也从简单的形态学上的描述鉴定发展到构建了现代科学的分子进化树[2]。本文尝试通过简单的商业化API试剂条对6种双歧杆菌进行鉴定。

1 材料与方法

①试验中用到的标准菌株：长双歧杆菌（ATCC15707）、短双歧杆菌（ATCC15700）、青春双歧杆菌（ATCC15703）、婴儿双歧杆菌（ATCC15697）、动物双歧杆菌（CICC6165）。②试验中菌株的复苏培养使用的培养基为商业化的MRS培养基，主要成分及配制方法：蛋白栋10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸三2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，琼脂粉15.0 g。将上述成分加入1 000 mL蒸馏水中，加热溶解，校正pH 6.2后分装，121 ℃高压灭菌15 min[4]。③生化鉴定使用商业化的API20A与API50CH试剂条。

2 试验过程

实验过程与最终鉴定标准参照GB 4789.34-2016。为了保证菌株的活性和稳定性，先将菌株在MRS培养基上厌氧培养划线分离复苏培养一代，再分别按照说明书使用API20A与API50CH试剂条配备的培养基（API50CH使用的是API50CHL培养基）配制菌液进行试剂条的加样，并将添加好试剂的试剂条放于厌氧罐中，在36 ℃下培养。

3 试验结果观察

实验条每24 h观察一次并记下结果，直到生化反应试剂条颜色不再改变，其结果如下。

3.1 API20A结果

反应24 h后滴加BCP的结果基本不再改变。所有的菌株测试结果输入数据库中皆能鉴定出为双歧杆菌属。分别落在其数据库分类的双歧杆菌属一类与双歧杆菌属二类中。根据数据库反馈的结果并不能将菌株鉴定到种。虽然，数据库分类结果提示试验还能通过附加试验——牛奶消解试验、淀粉分解试验、β-GP试验等，进一步进行种的分类，但最终只能鉴定出其中的3种双歧杆菌种。

3.2 API50CH结果

反应24 h后开始观察并记录结果，每24 h观察记录一次。由于API50CH试剂条设计为乳杆菌的鉴定，其数据库中并不能将结果鉴定为双歧杆菌。所以，本实验参考了国家标准GB4789.34-2016里双歧杆菌鉴定的生化鉴定结果进行人工鉴定对比。结果发现，API50CH试验所得的结果并不能与国家标准鉴定结果对应，尽管结果只代表90%的菌株情况，在后续没有其他实验指标的支撑下，最终难以得到让人信服的结果。而且，在试验观察中，API50CH中的某些反应缓慢阳性需要等待长达5 d才能趋于稳定不再改变，无形中对试验的鉴定结果时效性产生了重要影响。

4 结果与讨论

API鉴定系统对于这6株菌株在属水平上的鉴定是可以肯定的，但在种上的鉴定仍未能完善和涉及，这与双歧杆菌生化反应的多变特殊性不无关系。其中，多种糖发酵生化反应涉及缓慢发酵的情况，往往对结果的判断影响较大。因此，不能简单地以阳性阴性一刀切的方式进行判断，但是一旦将反应时间延长，一些环境因素引起的不确定性又会降低判定的准确性。现在国际上并没有统一通行的双歧杆菌鉴定方式，特别在生化反应这一方面，双歧杆菌在种与种之间也没有特殊肯定的反应鉴别特点，这无疑成为在只使用生化反应对双歧杆菌鉴定到种的情况难以得到满意结果的原因[5-7]。

当然，使用最有效的分子手段，对菌株的关键遗传信息进行测序，是现今细菌鉴定最为认可、准确和直接的手段[1]。但这又往往对实验室与实验人员以及成本与检测时间有特殊的要求，目前的条件难以普及和做到实效。

另外，笔者认为，在日常的食品检测中，对双歧杆菌的鉴定要鉴定到种的要求是否有必要也值得深思。

[1]周芳烨，梁国光，刘吉成.双歧杆菌种类鉴定的基因学方法[J].齐齐哈尔医学院学报，2006，27（9）：1088-1089.

[2]刘 洋，张清平，段文锋.双歧杆菌分子分型鉴定研究进展[J].中国乳品工业，2014，42（5）：43-47.

[3]张 勤，罗 燕，杨尔哈，等.双歧杆菌分离鉴定的方法及其应用[J].畜牧与饲料科学，2010，31（3）：10-13.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌检验[S].北京：国家标准出版社，2016.

[5]Martinez R C R，Wachsman M，Torres N I，et al. Biochemical, antimicrobial and molecular characterization of a noncytotoxic bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum, ST71KS[J].Food Microbiology，2013，34（2）：376-381.

[6]Guo X F，Wei Y L，Wang Y，et al.Identification of Bifidobacterium longum from Centenarians’ faeces and manufacture of fermented carrot juice[J].Journal of Agricultural Science & Technology，2015（1）：23-29.

[7]Bunešová V，Vlková E，Killer J，et al.Identification of Bifidobacterium strains from faeces of lambs[J].Small Ruminant Research，2012，105（1-3）：355-360.