索琳格，吴佩，张文博，杨志峰，刘慧英，崔金霞*

（石河子大学农学院园艺系/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832003）

黄瓜（ L.）属于典型的喜温性蔬菜，在保护地冬春栽培中常遭遇低温伤害，同时由于自身耐冷性差，严重影响其生长发育、产量和品质[1-2]。叶绿体是最容易受低温伤害的器官之一，低温抑制叶绿体发育，使活性氧积累，造成明显的植物细胞膜系统的破坏，从而使叶绿体功能紊乱，因此研究增强黄瓜耐低温能力具有重要意义[3]。

一氧化氮（nitric oxide，NO）作为生物活性物质和内源信号分子，参与植物生长发育过程及胁迫响应，适宜浓度NO通过多种方式参与调节植物对逆境胁迫的应答过程[4-5]，如低温、高温、盐害、干旱等[6-7]。这其中包括调控植物体内的AsA-GSH循环维持植物体内氧化还原状态和ROS稳态，增强其对逆境胁迫的耐性[8-9]。还原型谷胱甘肽（GSH）是一种低分子量水溶性硫醇化合物，它分布在植物的所有亚细胞或细胞器中[10-11]。GSH既参与植物生长发育的各种过程[12-13]，也是一种非生物胁迫耐受性的小分子抗氧化剂[14-15]，以多种途径提供抗氧化防御。首先GSH可直接与O2·-、OH·和H2O2反应形成加合物清除自由基；其次GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成水，其自身被氧化为GSSG（氧化型谷胱甘肽），GSSG 在谷胱甘肽还原酶的作用下，从NADPH 接受氢又重新被还原为GSH[16]，再者，GSH调节抗氧化酶系统，有助于维持ASA-GSH循环通路组分的减少，DHAR催化GSH还原DHA生成AsA[17]。此外，NO与GSH形成的GSNO调节NO水平和蛋白质巯基亚硝基化修饰影响生物体多种信号传导和生物体防御应答，近期的研究表明GSH作为一种信号分子与其他信号分子存在交互作用，从而增强植物对逆境的适应[18]。

相关研究文献表明低温下外源喷施NO供体SNP（亚硝基铁氰化钠）通过增强GSH-AsA循环效率和相关酶活性清除ROS提高植物耐低温能力，但植物存在多种清除ROS的途径，NO清除ROS也存在多种信号路径，GSH的抗氧化性能在NO增强植物的耐冷性中是否是必须的尚不明确。BSO能选择性地抑制γ-谷氨酰半胺氨酸合成酶（γ-ECS），从而阻止了谷氨酸与半胱氨酸合成二肽，进而使GSH不能合成、NADPH合成酶抑制剂6-AN（在叶绿体中AsA-GSH循环系统中需利用NADPH提供的电子将H2O2还原成水，用来清除H2O2）。因此，本研究利用SNP为外源 NO供体、GSH合成酶抑制剂BSO，以黄瓜为试材，拟通过探究低温胁迫下GSH参与外源NO对黄瓜叶绿体H2O2和O2˙-含量、抗氧化酶、还原力水平及氧化还原状态方面的影响，以期进一步从细胞器水平揭示GSH在NO调控黄瓜叶绿体抗氧化系统抵抗低温胁迫中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试材

选用黄瓜品种津研四号。

1.1.2 主要试剂与设备

试剂：SNP（亚硝基铁氰化钠）、BSO（丁硫氨酸亚砜胺）、6-AN（6-氨基烟酰胺）均购自Sigma公司，草炭购自德国Floragard公司。

设备：RXZ-300C智能人工气候箱（宁波江南仪器厂）；Percival E-36L植物培养箱（Percival，美国）等。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

筛选籽粒饱满的黄瓜种子，55℃浸种25 min后，室温浸泡 6 h，置于 RXZ-300c型智能人工气候箱（宁波江南仪器厂生产）内28℃黑暗催芽24 h，选择芽长一致种子播于72孔穴盘，混合基质采用草炭、蛭石（ ∶ =2∶1），每孔 1粒，覆混合基质厚度约 0.5-1.0 cm，待2片子叶完全展开时移入装有混合基质的花盆 （直径×高，120 mm×110 mm），每盆一株，250 mL Hoagland营养液（1倍）每隔4 d浇灌一次，待2片真叶展平，移入Percival E-36L植物培养箱（Percival，美国），设置环境条件为昼 25℃/14 h，夜20℃/10 h，光照强度300 μmol/（m2·s1），相对湿度60%，培养箱内适应2 d后进行试验处理，如表1所示，分别在 10：00和 18：00进行以下 4个试验处理（黄瓜幼苗叶片正反面均匀喷施以下药物），处理 2天。

表1 不同药剂处理时间与方法Tab.1 Treatment time of different chemicals

1.2.2 测定项目与方法

1.2.2.1 叶绿体的制备

叶绿体提取在叶济宇[19]和Robinson[20]方法的基础上加以改进。取出后用5倍体积的25 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.8）稀释，其中包含0.2 mmol/L EDTA和2%（W/V）PVP。4℃条件下，1200× g离心20 min，上清液用于测定叶绿体内超氧阴离子自由基（O2·-）含量、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏酸还原酶（MDHAR）活性和谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸(AsA)的含量；以丙酮悬浮叶绿体用于测定H2O2含量。

1.2.2.2 叶绿体被膜完整性的测定

应用希尔反应的原理测定叶绿体的完整性，叶绿体的颗粒比较大，分离和制备时一般采用差速离心技术，当细胞破碎后选择1500×g离心力进行分布离心，可分离沉淀出叶绿体；再通过测定叶绿体的光合速率或希尔反应中的放氧情况则可以鉴定其生理活性。离体后的完整叶绿体与2，6-二氯酚靛酚（2，6-DPIP）在光下可使水光解释放氧气，同时2，6-DPIP由蓝色被还原为无色或粉红色，可用分光光度计测定反应前后染料吸光度的变化表示氧气的释放量。

1.2.2.3 各项指标测定

O2·- 含量的测定采用羟胺氧化法[21]，H2O2含量的测定根据四氯化钛检测法[22]的方法，GR活性测定参考 Rao等[23]的方法，POD用愈创木酚法[24]测定，CAT活性检测参照 Patra等[25]方法。

APX测定按照 Nakano and and Asada（1981）[26]的方法测定，在25℃下进行反应。利用紫外可见分光光度计观察其在290 nm下的动力学变化情况。观察每隔30 s OD值的变化来计算酶促反应速率。

MDHAR活性的测定参照文献 [27]中的方法，DHAR活力的测定参照文献[28]中的方法。

GSH和 GSSG含量、AsA和 DHA含量、NADPH和NADP+含量测定按照试剂盒(南京建成，中国)的方法测定，并计算 GSH/GSSG、AsA/DHA、NADPH/NADP+比值；叶片丙二醛（MDA）含量的测定参照硫代巴比妥酸（TBA）比色法[29]。

1.2.3 数据处理

采用Excel 2013处理数据，SPSS 21软件进行统计分析，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验（ ＜0.05），用 ORIGIN PRO 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶片丙二醛含量的影响

由图 1可知：低温 24 h后，与 CK相比，水+SNP处理的黄瓜叶片MDA含量显著降低，降低了18.9%；与水 +SNP处理相比，BSO+SNP、6AN+SNP处理MDA含量则显著上升，分别增加了16.6%和19.4%，说明低温下GSH参与了NO降低黄瓜叶片膜脂过氧化程度和细胞膜透性的下降。

图1 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶片质膜透性和丙二醛的影响Fig.1 GSH involved in the effect of nitric oxide on MDA content of cucumber seedling leaves under low temperature stress

2.2 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶绿体H2O2和O2˙-的影响

由图 2可知：低温 24 h后，与 CK相比，水+SNP处理的黄瓜叶绿体中H2O2和O2·-含量显著降低，分别降低了13.1%和22.6%；与水+SNP处理相比，BSO+SNP、6AN+SNP 处理 H2O2和 O2·-含量则显著上升，H2O2含量分别增加了 44.9%和28.7%，O2·-含量分别增加了78.2%和67.8%，说明低温下GSH参与了NO降低黄瓜叶绿体内活性氧的积累。

图2 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶绿体H2O2和O2˙-的影响Fig.2 GSH involved in the effect of nitric oxide on H2O2and O2˙-content in chloroplasts of cucumber under low temperature stress

2.3 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶片叶绿体抗氧化酶的影响

由图3可知：低温胁迫下，外源水+SNP处理黄瓜叶绿体的 CAT、GR、POD、APX、MDHAR 和 DHAR明显高于 CK，分别提高了 62.2%、48.0%、43.7%、38.5%、49.3%和 39.8%；与水 +SNP处理相比，BSO+SNP 和 6AN+SNP 处 理 下 的 CAT、GR、POD、APX、MDHAR和DHAR活性均显著下降。这说明GSH参与了 NO增强黄瓜叶绿体 CAT、GR、POD、APX、MDHAR和DHAR的活性，可维持黄瓜叶绿体的抗氧化酶活性，从而提高活性氧清除能力。

图3 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶片叶绿体抗氧化酶的影响Fig.3 GSH involved in the effect of nitric oxide on antioxidase in chloroplasts of cucumber under low temperature stress

2.4 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶绿体还原力水平和氧化还原状态的影响

图4 显示：与CK相比，黄瓜幼苗叶片低温24 h后，水 +SNP处理的 GSH、AsA、NADPH含量和GSH/GSSG、AsA/DHA、NADPH/NADP+ 比值分别提高了 22.4%、31.3%、26.8%和 18.1%、38.5%、7.2%；与水 +SNP处理相比，BSO+SNP和 6AN+SNP处理的GSH、AsA、NADPH 含 量 和 GSH/GSSG、AsA/DHA、NADPH/NADP+比值均显著低于水+SNP处理。

GSH/GSSG、AsA/DHA 和 NADPH/NADP+是植物体内重要的3对氧化还原对，其比值的高低反映了黄瓜叶绿体内的氧化还原状态。以上结果表明GSH参与了NO提高黄瓜叶绿体的还原力水平，同时也说明3对氧化还原对的比值与叶绿体中还原力GSH、AsA和NADPH的水平高低密切相关。

图4 GSH参与NO对低温胁迫下黄瓜叶绿体还原力水平和氧化还原状态的影响Fig.4 GSH involved in the effect of nitric oxide on the reducing power and redox state in chloroplasts of cucumber under low temperature stress

3 讨论

（1）在正常生长条件下，植物叶绿体活性氧的形成和清除间保持一种动态平衡，而在低温胁迫下活性氧如超氧阴离子自由基（O2·-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH·）及单线态氧（1O2）等大量产生打破动态平衡，导致膜系统受损。已有研究表明低温胁迫下NO能够通过提高植物光合作用，诱导抗氧化酶活性和抗氧化物质的增加清除过多的ROS，增强黄瓜的耐冷性[2，6]。GSH作为小分子非酶强抗氧化剂可直接与O2·-、OH·和H2O2反应形成加合物清除自由基，还可以通过 AsA-GSH循环、GRX(glutaredoxin)、GST(glutathione S-transferase)等酶促反应清除ROS，提高植物的抗逆性[10，30]。

本文研究结果显示，低温24 h后，与CK相比，水+SNP处理的黄瓜叶片中MDA含量、叶绿体中H2O2和O2·-含量显著降低；与水 +SNP处理相比，BSO+SNP、6AN+SNP处理抑制了SNP的效果，说明低温下GSH参与了NO降低黄瓜叶绿体内活性氧的积累，降低氧化损伤。

（2）GSH能促进叶绿体的AsA-GSH循环，使叶绿体内的 AsA含量增加，APX、MDHAR和 GR等活性相应增加，这些酶之间的协调作用，可清除体内的活性氧，维持叶绿体内较低的膜脂过氧化水平[31]。植物细胞的叶绿体、细胞质、线粒体等细胞器中都含有较高浓度的GSH。AsA、GSH和NADPH是植物氧化还原反应中重要的H+供体，其水平的高低是衡量植物还原库力水平高低的重要指标；GSH/GSSG、AsA/DHA 和 NADPH/NADP+是植物体内维持氧化还原平衡的3对重要氧化还原对[32-33]。

本文试验结果表明，低温胁迫24 h后，水+SNP处理黄瓜叶绿体的 CAT、GR、POD、APX、MDHAR 和DHAR酶活性以及 GSH、AsA和 NADPH含量，GSH/GSSG、AsA/DHA及 NADPH/NADP+明显高于CK，与水 +SNP处理相比，BSO+SNP、6AN+SNP处理削弱了SNP作用的发挥，说明GSH及其参与的AsA-GSH循环在NO增强黄瓜叶绿体抗氧化酶活性，清除ROS提高黄瓜耐冷性中充当着重要角色，同时外源NO诱导了抗氧化物质GSH、AsA的积累和还原力水平的提高，增强了黄瓜在低温胁迫下清除ROS毒害能力及使细胞氧化还原平衡处于还原状态，从而有效缓解低温胁迫危害。

（3）近期研究表明GSH作为不同的生化反应的辅助因子，与激素、信号分子，氧化还原状态的触发的信号转导存在相互作用[18，34]。

本文试验结果表明，在低温24 h后，采用GSH合成抑制剂BSO抑制GSH 合成，或者采用6-AN使GSH/GSSG氧化还原信号循环失效，都会降低NO的作用效果，表明GSH在NO的下游发挥着重要作用，但其作为信号的角色仍需进一步深入研究。

4 结论

综上所述，在低温胁迫下，外源NO供体SNP的施用使低温胁迫下黄瓜叶片MDA含量、叶绿体中H2O2和O2·-的产生和积累减少，提高了黄瓜叶绿体细胞内的抗氧化酶活性，调节细胞氧化还原平衡处于还原状态，从而有效缓解了低温胁迫对黄瓜植株的氧化胁迫损伤，而BSO抑制GSH合成和6AN抑制GSH再生均会阻碍SNP的作用效果。因此GSH在NO增强植物耐冷性中发挥着非常重要的作用。