李忠晴，柴武慧，张云川，黄叶红，李金环，鲁培鑫，闫洁*

（石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832000）

蛋白质样品制备方法是蛋白质组学分析的关键[1]，制备的样品会影响到得到的双向电泳 (twodimensional dimensional electrophoresis，2-DE)图谱中的蛋白点的数目、性状，蛋白的溶解以及实验的重复性。植物材料不同于动物和微生物材料，植物组织中的蛋白质的相对含量较低。植物细胞中存在着的细胞壁及液泡、蛋白酶、氧化酶以及植物组织中含有的色素、多糖、酚类和醌类等次生代谢物质会影响植物蛋白的提取质量并最终影响到双向电泳的效果[2]。虽然对于植物组织或细胞的蛋白质的提取有许多方法，即使是同一种植物不同组织器官的最适蛋白质提取方法也是不相同的。最佳的提取方法是需要摸索实验的，为了减少蛋白中的杂质以及蛋白提取过程中的降解和后期修饰[3-4]，建立适合的双向电泳体系，从蛋白质组学的角度对植物开展研究。

天然橡胶是一种独特的且在经济上有重要作用的生物聚合物，目前主要由橡胶树（Hevea brasiliensis）生产[3]。受气候因素限制，国内橡胶树仅分布在热带作物区，种植范围有限[4]，与此同时，橡胶树还面临着严重的病害侵袭，例如橡胶树死皮病、白粉病、割面条溃疡病、根病、炭疽病等造成橡胶树胶乳的产量下降，品质降低[5-6]。橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin[5]，TKS）是菊科蒲公英属的草本植物，橡胶草在[6]专门生产胶乳的管状细胞中合成的高分子量顺式-1，4-聚异戊二烯能够满足工业生产需要，为天然橡胶的生产提供了一种新的来源[7]。橡胶草可产生高质量的天然橡胶，与橡胶树相比，橡胶草具有地理适应范围广、适应性强、生长周期短（当年可积累橡胶10%）、适合机械化生产、可大面积种植以及存活率高等优点，且组织培养、遗传转化与基因编辑较容易[7]，是最有可能替代巴西橡胶树生产天然橡胶的经济作物[8]。

目前有相关的研究报道有关橡胶草的开花和农艺性状、无菌体系建立、基因克隆等工作已有报导[9-15]，但并未有橡胶草蛋白方面的研究。因此，对橡胶草进行蛋白水平上的研究具有重要现实意义。本研究通过5种方法提取橡胶草叶片蛋白质，并且对其提取率和双向电泳图谱的效果进行比较，初步建立了一套适合于橡胶草叶片蛋白质组学研究的蛋白的提取方法和双向电泳体系，为后续的相关的实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

新疆野生型橡胶草无菌苗由石河子大学农业与生物技术重点实验室培养。

1.1.2 实验试剂

丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、甲叉丙烯酰胺（N，N-methyenebisacrylamide，Bis）、甘氨酸（Glycine）、十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl sulfate，SDS）、三羟甲基氨基酸甲烷（Tris aminomethane Tris-base）、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、二硫苏糖醇（1，4-dithiothreitol，DTT）、N，N，N’N’- 四甲基二乙胺 （N，N，N'，N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED）、过硫酸铵（Ammomium persulfate，AP）、考马斯亮蓝R-250（CCB R-250）、矿物油（Mineral Oil）、碘乙酰胺（Iodoacetamide）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）购买于Amresco公司，固相pH梯度预制胶条（IPG 17 cm、7 cm，pH molecular；pH 3-10 线性、pH 5-8 线性）、载体两性电解 质 （Bio-LyteTM3-10/5-8Ampholyte，40%（W/V））购买于美国BIO-RAD公司，三氯乙酸（TCA）、甲醇、乙醇、丙酮等其他国产分析纯试剂。

1.1.3 实验仪器

紫外可见分光光度计（752S）、真空冷冻干燥机、离心机 (Eppendorf 5418，德国)、电热恒温水浴锅(CS501-SP)、微 波 炉 (HR-7751MS)、IPG phor 等 电 聚焦仪（美国Bio-Rad公司）、PowerPacTM通用电泳仪电源（美国 Bio-Rad公司）、PROTEAN Plus Dodeca高通量电泳槽（美国 Bio-Rad公司）、PROTEAN Plus多板凝胶灌胶器（美国 Bio-Rad公司）、PROTEAN Plus合叶式玻板（美国 Bio-Rad公司）、ImageScanner凝胶成像系统（美国GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

在16 h光照/8 h黑暗光照条件、22℃恒温的培养环境中，将橡胶草无菌苗叶柄及叶片剪成1 cm×1 cm左右的叶盘，置于MS培养基（含8 g/L琼脂条、30 g/L蔗糖、6-BA(6-Benzylaminopurine)1.0 mg/L、NAA(1-naphthylacetic acid)0.1 mg/L）生长 11 d左右开始长出愈伤，掰取愈伤分化的幼芽于新的MS1培养基中继续生长15 d后转移到MS2生根培养基中（含 8 g/L琼脂条、25 g/L蔗糖、NAA 0.5 mg/L），1个月后将生根的幼苗移栽到含有营养土∶蛭石=3∶1的花盆中继续生长。选择生长期3个月长势良好且均匀的橡胶草植株作为材料，每3株随机选取从倒三叶开始的5片叶子为1个样品，用液氮速冻保存于-80℃冰箱，备用。

1.2.2 TCA-丙酮法

称取1 g叶片，在液氮冷冻条件下研磨至粉末，加 0.03 g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）研磨，加 4.5 mL用丙酮配制的10%TCA溶液(W/V)（含20 mmol/L DTT），混匀于 -20℃冰箱沉淀过夜，后 15，000 r/min 4℃离心20 min，沉淀分别用80%和100%预冷的丙酮洗涤各1次，洗涤后用同上一步的离心方法离心，沉淀冷冻干燥后溶于适量裂解液中或保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.3 改良TAC-丙酮沉淀法

称取 1 g叶片，加 0.1 g PVPP，在液氮冷冻条件下研磨至粉末，加入7.5 mL预冷的蛋白质提取液Ⅰ（含 10%TCA和 0.07%的β-巯基乙醇），涡旋混匀，-20℃降解 1 h；在 4℃条件下，15，000 r/min离心20 min，沉淀加7.5 mL预冷的蛋白提取液Ⅱ（含0.07%的β-巯基乙醇），涡旋混匀，-20℃降解 2 h；15，000 r/min在 4 ℃下离心 20 min，重复2次；沉淀用80%预冷的丙酮洗涤3次，直至沉淀颜色发白。去上清，冷冻真空干燥。

1.2.4 酚-乙酸铵沉淀法

称取1 g叶片，在液氮冷冻条件下研磨至粉末，加预冷丙酮（含 20 mmol/L DTT）混匀洗涤 2次，每次洗涤后 15，000 r/min 4℃离心 20 min，沉淀在冰上干燥后加4 mL提取缓冲液用研钵研磨成匀浆，加等体积的 Tris-酚混匀 1 h，15，000 r/min 4℃离心20 min，酚相加入3倍体积0.1 mol/L乙酸铵甲醇，于-20℃冰箱沉淀过夜，后在条件下15，000 r/min离心20 min，沉淀冷冻干燥后溶于适量裂解液中或保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.5 Tris浸提法

称取鲜样1 g于液氮预冷的研钵中，加入10%（w/v）PVPP研磨直至细粉末（约加液氮5-6次），粉末加入10 mL蛋白提取缓冲液，将离心管置于超声波破碎仪上抽提 1 h；4 ℃，15，000 r/min离心 20 min；取上清，加入3倍体积的-20℃预冷的10%TCA丙酮溶液，充分混匀后置于-20℃ 1h，使蛋白沉降；4 ℃，15，000 r/min 离心 20 min，弃上清，沉淀重新悬浮于等体积预冷丙酮（含0.07% β-巯基乙醇）和80%预冷的丙酮各洗涤 2次；4℃ 15，000 r/min离心20 min；沉淀真空冷冻干燥后-80℃保存。

1.2.6 直接提取法

称取鲜样1 g于液氮预冷的研钵中，研磨直至细粉末（约加液氮5-6次），粉末转移至预冷的50 mL离心管中，加8 mL提取液（7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲，2%CHAPS），置于冰上振荡 3 h后，在4℃条件下15000 r/min离心20 min，将上清转至另一预冷的50mL离心管中，加25 mL在-20℃预冷的丙酮（含0.07%巯基乙醇），于-20℃沉淀过夜，15000 r/min离心20 min，沉淀先用预冷的无水乙醇洗涤2次，后80%的丙酮洗涤沉淀1次，将沉淀于-20℃至丙酮挥发干净。

1.2.7 标准曲线

溶解后的蛋白质样品溶液参照Bradford[16]的方法进行蛋白质定量，测定蛋白质样品的浓度，确保蛋白质的样品上样量相同，以BSA（牛血清蛋白）作为标准曲线，且每次提取的蛋白质都单独绘制标准曲线，并保证曲线的相关系数达到0.99以上。

1.2.8 凝胶染色

采用考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法两种染色方法进行染色。

考马斯亮蓝染色法：凝胶用染色液染色（2.5%R-250，50%甲醇，40%冰乙酸）3-6 h，经超纯水漂洗2-3次，后使用脱色液（50%甲醇，40%冰乙酸）脱色2-3次，再用超纯水漂洗去除背景颜色。

硝酸银染色法：漂洗：取出的凝胶用超纯水漂洗2次，每次 1 min；变性：放入 25%乙醇 3 min，超纯水漂洗1次；固定：1%硝酸银溶液3 min，超纯水漂洗1次；染色：0.2%硝酸银溶液30 min，超纯水漂洗2次；显色：0.2%甲醛、3%碳酸钠溶液至看到清晰的蛋白点；终止：10%冰乙酸溶液1 min。

1.2.9 凝胶扫描

脱色后的凝胶利用ImageScanner凝胶成像系统扫描获取图谱，分辨率为300 dpi。

1.2.10 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2010统计和作图，通过SPSS 20软件进行方差分析检验其差异显著性，方差比较采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 不同方法蛋白提取率的比较

为探究不同蛋白提取方法的优劣，在样品鲜重的质量均为1 g的条件下，分别对用5种蛋白提取方法得到的橡胶草叶片蛋白的干粉质量、浓度和提取率进行比较。结果表明（表1），直接提取法得到的蛋白干粉量最少，仅有25.3 mg，且溶解后的蛋白浓度较低；酚-乙酸铵沉淀法和Tris浸提法提取得到的蛋白质的浓度较高，分别为3.326 mg/mL和4.118 mg/mL；改良TCA-丙酮法得到的蛋白质干粉质量最多，是直接提取法得到的蛋白质干粉质量的12.658倍，且蛋白的提取率最大。改良TCA-丙酮法得到的蛋白质干粉质量和蛋白质提取率与其他蛋白质提取方法相比达到显著水平（ ＜0.05），综合以上结果认为，橡胶草叶片蛋白的提取可以采用酚-乙酸铵沉淀法、Tris-HCl法和改良TCA-丙酮法。

表1 不同提取方法对橡胶草叶片提取效率的比较Tab.1 Comparison of Taraxacum kok-saghyz Rodin leaf protein extraction results with different methods

2.2 不同提取方法的SDS-PAGE电泳结果

为进一步探究最适的蛋白提取方法，对5种蛋白质提取方法提取的蛋白进行了SDS-PAGE电泳检测(图 1)。

图1 5种方法提取橡胶草叶片蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE map of extracted proteins from Taraxacum kok-saghyz leaf by five methods

参照Bradford的方法测定裂解的蛋白质浓度后，在确保每个泳道蛋白的上样量以及上样体积相同的条件下，结果如图1所示。其中，2、3、4泳道分别为改良TCA-丙酮法、酚-乙酸铵沉淀法和Tris-HCl浸提法提取的蛋白，在其泳道中既有高丰度的蛋白条带，也有低丰度的蛋白条带，而且蛋白条带数目近似相同；1和5号泳道为TCA-丙酮法和直接提取法得到的蛋白，在1号和5号泳道中只有高丰度的蛋白条带，缺少低丰度的蛋白，且蛋白条带数目较少。因此，根据蛋白提取率的比较以及SDS-PAGE电泳检测的结果，认为橡胶草叶片蛋白的提取选择酚-乙酸铵沉淀法、Tris-HCl法和改良TCA-丙酮法这三种方法进行第二向的电泳比较。

2.3 3种提取方法总蛋白双向凝胶电泳

在得到不同提取方法提取效率和SDS-PAGE电泳图谱的基础上，选择酚-乙酸铵沉淀法、Tris-HCl法和改良TCA-丙酮法提取的总蛋白进行7 cm、pH 3-10双向电泳。

结果如图2所示，采用Bradford的方法测定裂解的蛋白质浓度后，在等电聚焦时蛋白质的上样量为 200 μg，上样的体积为 200 μL，在相同上样量和电泳的条件下，酚-乙酸铵沉淀法提取的蛋白在胶图上的点有横竖条纹，蛋白点没有完全分离开；Tris-HCl法提取的总蛋白在胶图上的蛋白点模糊不清晰，部分蛋白点发生重叠和堆积现象；改良TCA-丙酮法提取的蛋白质图谱中得到的蛋白点数目多于其他两种方法且横纹较少没有发生蛋白点的重叠和堆积现象。综合以上实验，选择改良TCA-丙酮法作为橡胶草总蛋白的提取方法。

图2 不同提取方法的7cm胶条的2-DE图谱[013]Fig.2 2-DE map of extraction with different methods about 7cm gel strips

2.4 不同上样量及染色方法的比较

为探究不同染色方法和 900 μg、1200 μg 和1500 μg蛋白上样量对双向电泳结果的影响，采用改良TCA-丙酮法提取橡胶草总蛋白，选用17 cm、IPG胶条范围为pH 3-10的胶条进行凝胶电泳，并分别使用考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法两种方法进行染色，得到的结果如图3所示，经硝酸银染色后，图谱中存在较多的横纹，而经考马斯亮蓝染色后的图谱中横纹少。

在均采用考马斯亮蓝染色法的前提下，通过对不同上样量进行比较后发现，蛋白上样量为1200 μg时，能够得到清晰的蛋白点；在蛋白的上样量为900 μg时，图谱中的蛋白数目较少且不够全面；当蛋白的上样量为1500 μg时，存在蛋白点的覆盖现象，不能得到理想的蛋白图谱。综合以上结果认为，橡胶草叶片蛋白双向电泳的最佳上样量为1200 μg，最佳染色方法为考马斯亮蓝染色法。

图3 不同上样量及染色方法的2-DE图谱Fig.3 2-DE gels of different sample load and stain methods

2.5 不同IPG胶条范围的比较

为进一步探究不同IPG胶条范围对2-DE电泳结果的影响，选择17 cm的pH范围为pH 3-10的线性胶条和pH 5-8的线性胶条，这两种不同范围的 IPG胶条，在蛋白上样量均为 1200 μg，染色方法为考马斯亮蓝染色法的条件下进行2-DE电泳。

结果表明，在17 cm pH 5-8胶条pH范围以外的碱性端和酸性端存在蛋白重叠并形成蛋白带 (图4B)；17 cm pH 3-10的线性胶条上酸性端和碱性端的蛋白没有形成蛋白带，分离效果较好，并且中性蛋白也均匀的分布，性状规则，没有拖尾(图4A)。pH 5-8胶条的2-DE图谱中的蛋白点数目并没有多于pH 3-10的线性胶条电泳2-DE图谱中的蛋白点数目。综合以上结果认为，橡胶草叶片总蛋白双向电泳的最适IPG胶条范围为pH 5-8。

图4 不同pH范围2-DE图谱Fig.4 2-DE gels of different pH range

3 讨论

蛋白样品的提取对双向电泳的效果产生重要影响，因此是建立双向电泳体系的开始且关键步骤。在植物蛋白质样品制备中，增加蛋白质纯化步骤致使选择性的丢失蛋白[17]；改良TCA-丙酮方法提取叶片全蛋白时操作步骤简单，能浓缩提取的蛋白，尤其是极碱性的蛋白和低分子量的蛋白[18]；同时可以除去一部分植物次生代谢物对实验的影响以及蛋白提取过程中的蛋白降解，因此在蛋白质组学研究中特别是植物组织的蛋白质提取的主要方法[18-20]。本研究在提取橡胶草叶片总蛋白时采用了5种提取方法进行比较，最终选择改良TCA-丙酮方法为提取橡胶草叶片蛋白的最适方法，这与胡敏对梨树叶片的研究结果一致[21]。

蛋白质的上样量大小和染色方法的选择会直接影响双向电泳效果，在双向凝胶电泳染色时最常用的方法有考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法[22]，其中考马斯亮蓝染色法的优点是在实验操作时可以得到较好的重复且操作简单具有可控性，但染色的灵敏度低，所需的上样量大。尽管硝酸银染色法具有高的灵敏度，所需的上样量少，但因其在染色时不易掌控染色的时间，且染色后与质谱的兼容性比不上考马斯亮蓝染色法，因此在后续的相关差异蛋白质组学研究中需要鉴定蛋白时应当优先采用考马斯亮蓝染色法。在蛋白质的上样量大小的选择时要考虑到包括低丰度蛋白的数目、蛋白的重叠以及图谱中蛋白点的清晰度，最佳上样量需要根据具体对象优化确定[23]。由于样品制备时不能完全去除其中的盐离子，上样量增大的同时会提高蛋白上样溶液中的盐离子和其他杂质的含量，影响第一向的等电聚焦，导致在等电聚焦时无法达到预设电压，发生蛋白质的凝聚和沉淀析出，并导致蛋白质不能均匀分布在IPG胶条上，在最终的凝胶上低丰度的蛋白点被遮盖[24]，或者产生水平方向和垂直方向上的纹理现象[25]。上样量过低，较低丰度的蛋白点无法在图谱中显现出来而无法检测，进而影响全蛋白图谱蛋白点的准确识别。在本研究中，当选择17 cm、pH 3-10的 IPG胶条时，蛋白上样量分别为 900 μg、1200 μg和 1500 μg，并且比较了考马斯亮蓝染色法和硝酸银染色法，由于硝酸银染色后的图谱中产生较多的横纹，背景不能完全去除而掩盖一些蛋白点，所以在本实验中最佳的上样量为1200 μg时考马斯亮蓝染色法优于硝酸银染色法。

IPG胶条的不同pH范围的选择对于得到高分辨率的蛋白图谱是非常重要的。理论上是胶条的pH范围越宽，在SDS-PAGE凝胶图谱中会得到更多的蛋白点[26]，首先用pH范围较宽的胶条来确定蛋白质的分布区域，然后采用pH范围窄的胶条来分离目标蛋白或者增加低丰度蛋白的数量，同时减少蛋白在凝胶图谱中的重叠现象。采用pH 3-10和pH 5-8两种不同pH范围的IPG胶条[18,19]进行2-DE凝胶电泳，得到的蛋白电泳图谱进行比较，从而选择合适范围的胶条。在本实验中首先采用了pH范围为3-10的IPG胶条对橡胶草叶片蛋白质样品进行2-DE凝胶分离，得到的凝胶图谱中的大部分蛋白点分布均匀，且检测到的蛋白点数目较多。之后采用pH 5-8的IPG胶条进行2-DE凝胶分离时，大部分蛋白集中分布在酸性端和碱性端，因此不适合橡胶草叶片全蛋白的双向电泳。故本实验选择pH范围为3-10的IPG胶条进行双向电泳。

4 结论

本研究结果表明，改良TCA-丙酮法对橡胶草叶片蛋白的提取效率最高；采用17 cm、pH 3-10 IPG胶条，1200 μg蛋白上样量和考马斯亮蓝染色法，能够得到质量最优的图谱，是橡胶草叶片全蛋白进行双向电泳分离的最佳条件。