黄雪玲，付 洁

(1西北农林科技大学 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100；2 盘锦职业技术学院，辽宁 盘锦 124000)

小麦是世界范围内主要的粮食作物，在我国的播种面积以及产量仅次于水稻，为我国粮食生产的重要组成部分。由小麦条形柄锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici,Pst)引起的小麦条锈病一直是威胁我国主要产麦区的最重要病害之一。利用抗病品种和药剂防治是防控小麦条锈病的基本策略，而研究小麦条锈菌的致病机制将为制定小麦条锈病的防控策略提供理论依据。

早期对于小麦条锈菌致病机制的研究主要集中在病原菌侵染过程中超微结构和细胞化学、异核作用及非生物因子对条锈菌致病性的影响[1-4]。随着分子生物学技术及高通量测序技术的发展和完善，包括小麦秆锈菌(Pucciniaf.sp.graminis)、小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)和Pst在内的一大批真菌都完成了基因组测序[5-6]，使得在基因组范围内对基因进行系统分析成为可能,其中研究较多的是真菌发育过程相关基因[7-10]、真菌侵染过程诱导表达的基因[11-12]及与信号传导相关的基因[13]。信号通路中的转录因子是细胞功能的关键调节因子，研究转录因子的调节机制对于了解细胞中各种生物学过程具有重要意义。根据Park等[14]对真菌转录因子的分类标准，小麦条锈菌的转录因子主要分为Zn2Cys6 锌簇、CCHC锌指、C2H2锌指、GATA因子、b-ZIP转录因子、APSES转录因子、Forkhead转录因子、热激因子、MADS-BOX因子、NFX1 转录因子、STE转录因子及TEA转录因子等类型。目前，在真菌中对于Zn2Cys6 锌簇、GATA因子、b-ZIP转录因子、MADS-BOX因子及STE转录因子均有较多的研究[15-19]。

STE转录因子是真菌中独有的一类转录因子，通常被称为Ste12转录因子。由于与MAPK途径存在密切关系，Ste12引起人们的广泛关注[19]。对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Ste12转录因子的研究结果表明，Ste12通过与其他基因形成两套不同的复合体，从而控制酿酒酵母的交配及菌丝形成[20]。在许多植物病原菌中也发现了STE转录因子。对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的研究发现，Ste12突变体形成的附着胞不能产生入侵栓[21]，说明Ste12直接参与了病原菌的入侵过程。对瓜类炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)的研究表明，Ste12不影响附着胞的发育，但是突变体缺乏果胶酶活性以及细胞表面黏附因子，导致不能对寄主进一步入侵[22]。Gu等[23]研究结果表明，Ste12转录因子对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的致病力也起到至关重要的作用，Ste12突变体在植物寄主中入侵和扩展能力明显丧失。以上研究结果表明，Ste12转录因子是决定病菌致病力的重要因素。因此，对该类基因的研究对于探索病菌致病机理具有重要意义。

通过对小麦条锈菌全基因组进行分析，笔者发现小麦条锈菌也存在STE类型转录因子。基于该类型转录因子在众多病菌中的重要作用，本研究拟鉴定克隆STE类型转录因子，分析其表达谱及转录活性，进而探索STE类型转录因子在小麦条锈菌与小麦互作中的功能，以丰富对小麦条锈菌转录因子的认识，为揭示小麦-小麦条锈菌互作的分子机制奠定基础，进而为制定小麦条锈病的防控策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试小麦(Triticumaestivum)品种水源11和小麦条锈菌CYR32生理小种，均由西北农林科技大学植物病理研究所提供。水源11与条锈菌CYR32组成亲和组合。

1.2 方 法

1.2.1 接种及取样 小麦植株的培育和小麦条锈菌的接种均按康振生等[24]的方法进行。分别于接种后12，24，36，48，120和216 h剪取接种叶片，液氮速冻后于―80 ℃保存备用。

1.2.2 总RNA提取与cDNA合成 采用RNA提取试剂盒(Invitrogen，USA)提取样品总RNA，然后用DNA酶Ⅰ对DNA进行去除。对于小麦条锈菌侵染的小麦叶片，采用液氮研磨的方法破碎细胞。对于小麦条锈菌夏孢子，采用液氮结合干冰的方法研磨样品，具体方法为：用液氮预冷研钵及研杵，在研钵中加入无菌的石英砂及干冰；用研杵将干冰捣碎后倒入100 mg小麦条锈菌夏孢子，迅速研磨至干冰即将完全升华时加入裂解液；待气体完全排除后，按试剂盒说明书中操作步骤进行。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性，并利用核酸蛋白检测仪NanoDropTM2000测定RNA的浓度及纯度。利用M-MLV反转录酶(Promega)对总 RNA 进行反转录得到cDNA。试验全程使用不含RNA酶的耗材，合成的cDNA模板10倍稀释后用于基因克隆和实时定量PCR分析。

1.2.3 小麦条锈菌PsSte12基因的克隆 本课题组之前已经获得小麦条锈菌CYR32全基因组序列，并且对所有预测的基因进行了功能注释[6]。从已有基因组序列中提取Ste12同源基因片段，将该序列与Broad institute数据库(https://data.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group/MultiHome.html)小麦条锈菌Pst78序列进行比较，最终确定候选PsSte12基因ORF序列。为证实该序列，采用Primer Premier 5.0软件设计扩增目的基因ORF的引物，上游引物序列为5′-ATGGCCGCTGAAGTTTCG-3′，下游引物序列为5′-TCATGAGGAATGGTCAGAG-3′。扩增反应模板为小麦条锈菌夏孢子cDNA与接种条锈菌后不同时间点小麦样品cDNA混合物。DNA聚合酶采用Prime STAR®HS DNA Polymerase(TaKaRa)。PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物回收(Bioteke)后克隆至pGEM-Teasy(TaKaRa)载体，将载体送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司，采用通用引物T7和SP6进行测序。

1.2.4 序列分析 使用Prot-Param (http://web.expasy.org/protparam/)预测PsSte12编码蛋白质的分子质量、等电点、不稳定指数、正负电荷残基数及原子组成；利用Inter-ProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/Inter-ProScan/)分析编码氨基酸保守结构域。利用9氨基酸转录激活域预测工具(http://www.med.muni.cz/9aaTAD/)预测转录激活域。利用DNAMAN软件分析目的基因氨基酸序列与其他物种序列的同源性，其他物种序列来源于NCBI数据库。同时，利用DNAMAN将目的基因的核苷酸序列与小麦条锈菌CYR32基因组序列进行比对，以期寻找到该基因ORF区域的内含子。

1.2.5 实时定量PCR分析 利用Primer Premier 5.0软件，根据候选PsSte12基因ORF序列设计特异引物(F：5′-TAGCGGACTCAGCAGTATAG-3′；R：5′-CCGCCTCTGTTTGTATGTAG-3′)。以小麦条锈菌Actin基因为内参基因[25]，利用CFX96TMReal Time System (Bio-Rad)进行小麦条锈菌侵染过程中PsSte12表达谱分析。PCR反应体系20 μL，包含10 μL SsoFastTMEvaGreen Supermix (Bio-Rad)，上下游引物(10 mmol/L)各0.8 μL，3 μL 10倍稀释的cDNA模板。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 40次循环；读板。扩增结束后，对熔解曲线进行分析以检测扩增产物的特异性，温度为65～95 ℃。所有试验样品均重复3次。同时，每对引物的扩增设未加模板对照，以检验PCR扩增的背景。所有引物进行扩增效率检测，扩增效率在90%～105%的引物符合要求。利用2-ΔΔCt法对内参基因和目标基因的数据进行分析，在试验中以小麦条锈菌夏孢子接种0 h样品作为对照，用以确定目标基因在侵染过程不同时间点的相对表达量。

1.2.6 转录活性分析 利用酵母单杂交系统对PsSte12蛋白的转录活性进行分析。将限制性酶切位点NcoⅠ(CCATGG)和BamHⅠ(GGATCC)分别引入扩增PsSte12 N-端片段PsSte12-304，PsSte12完整ORF片段PsSte12-850的上下游引物中(如序列中下划线所示)。上下游引物序列分别为(pSte304-fp：5′-CATGCCATGGAGATGGCCCA-CGCACAACAATTC-3′，pSte304-rp：5′-ATACGC-GGATCCCGGAAGAAGGGACGAGTAAGA-3′；pSte850-fp：5′-CATGCCATGGAGATGGCCCAC-GCACAACAATTC-3′，pSte850-rp：5′-ATGCGC-GGATCCCTTACATCCCATCAAAGACCG-3′)。以1.2.3节中构建好的载体为模板，利用上述引物进行扩增。扩增程序同1.2.3节，PCR反应体系100 μL。利用试剂盒(Bioteke)对PCR产物进行纯化，利用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ(Thermo scientific)对纯化产物和载体pGBKT7(Clontech)进行双酶切。PCR产物酶切体系60 μL，pGBKT7载体酶切体系80 μL，使用2×tango buffer、2×BamHⅠ和1×NcoⅠ，37 ℃酶切3 h。胶回收酶切产物，使用T4 DNA连接酶试剂盒(Thermo scientific)对目标片段和载体片段进行连接。对于PsSte12-850，做2个10 μL连接反应。反应1：目标片段与载体物质的量比为2∶1，连接程序为16 ℃ 10 min，20 ℃ 5 min，40 ℃ 2 min，40个循环后4 ℃保存。反应2：目标片段与载体物质的量比为5∶1，连接温度22 ℃，连接反应16 h。反应结束后，合并两管反应液。PsSte12-304与载体的连接方法同上述反应2。将上述两个片段与载体连接产物分别转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆酶切检测和测序验证。将通过测序验证的转化子转入含有His3和LacZ报告基因的酵母菌株AH109(Clontech)。再将阳性转化子转移到不含组氨酸及色氨酸的SD培养基上，用以筛选目标片段的转录激活功能。采用X-α-gal为底物，利用滤膜试验检验β-半乳糖苷酶活性。

2 结果与分析

2.1 PsSte12基因的克隆与序列分析

根据已有小麦条锈菌CYR32基因组序列以及基因注释，结合Broad institute数据库中小麦条锈菌Pst78序列，找到1个Ste12基因同源片段pst32 17249，并最终确定候选PsSte12基因ORF序列。为证实该序列，在此基因ORF两端设计引物，经RT-PCR扩增、克隆后测序。利用NCBI网站的ORF finder程序对此序列进行预测分析，发现该序列含有1个长度2 553 bp的开放阅读框(ORF)。该基因编码850个氨基酸，含有75个正电荷残基(Arg+Lys)和90个负电荷残基(Asp+Glu)。PsSte12蛋白含有12 829个原子，预测分子式为C4090H6247N1183O1283S26，分子质量为93 352.3 ku，等电点6.26。该蛋白的不稳定指数为55.33，所以此蛋白为不稳定蛋白。目前该基因已提交GenBank，登录号为KX761830。

对PsSte12保守结构域进行分析，发现氨基酸序列第71-178位为典型的STE结构域，第485-540位为zf-C2H2结构域。DANMAN分析PsSte12与其他物种Ste12氨基酸序列的同源性表明，该蛋白与小麦秆锈菌(XP_003325390.2)及杨树锈菌(XP_007418009.1)中同源序列的相似性为87.9%和61.53%，与小麦赤霉菌(XP_011327056.1)和构巢曲霉菌(cua71570.1)中同源序列的相似性分别为24.3%和25.2%，说明STE转录因子在锈菌目内比较保守。由图1可见，在PsSte12 N端具有明显的STE结构域，其中绿色划线部分为STE结构域的保守区；C端具有zf-C2H2结构域，与STE结构域相比，zf-C2H2结构域在真菌间的保守性较差。

2.2 PsSte12基因组序列分析

将PsSte12基因ORF序列在NCBI CYR32基因组中进行BLASTn比对，发现该基因存在于CYR32 contig_8271上。利用DNAMAN将目的基因的核苷酸序列与CYR32 contig_8271序列进行比对，显示该基因含有4个内含子，分别位于ORF序列第281，429，1 512和1 584位，长度分别为73，79，66和68 bp。

2.3 小麦条锈菌侵染过程中PsSte12的表达

利用实时定量PCR分析PsSte12在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达模式，结果如图2所示。

由图2可以看出，在小麦条锈菌侵染的前期，PsSte12的表达呈上升趋势，侵染后24和36 h，相对表达量分别达到对照表达水平的61和123倍；在接种后48 h，PsSte12相对表达量开始下降，直至接种后120 h，其表达量恢复到对照水平。

2.4 PsSte12的转录活性

将含有PsSte12-304、PsSte12-850的重组载体及对照pGBKT7载体分别转化酵母细胞AH109，继而在SD/-Trp-His-Ade+X-α-gal培养基上培养。结果(图3)显示，含有PsSte12-304和PsSte12-850的两个转化菌株都可以在三缺培养基上生长，并且转化菌株可以被X-α-gal染成蓝色。仅转化空载体的转化菌株不能在三缺培养基上生长。以上结果说明，含有PsSte12-304和PsSte12-850的重组载体都可以激活酵母下游的His3和LacZ报告基因，同时PsSte12蛋白的N端第1-340位具有转录激活功能。利用转录激活域预测软件对PsSte12的预测结果显示，该蛋白N端第144-152位的SDFLELLFK序列组成一个匹配度很高的转录激活域，该位点很有可能就是PsSte12的转录激活位点。

3 讨 论

第一个Ste12基因发现于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[26]，该基因在酿酒酵母中对细胞形态和信号转导起调控作用。此后，大量Ste12基因从多种腐生或寄生的真菌中被鉴定出来[21-23,27]。Ste12蛋白以N端存在类似homeodomain motif的STE结构域为典型特征，存在于homeodomain第3个螺旋的KQKVFFWFSVA序列在所有真菌Ste12蛋白中高度保守[28]。本研究鉴定的PsSte12除含有第71-178位的STE结构域外，在第485-540位含有一个zf-C2H2结构域，该结构域在不同类型真菌中存在高度的分化。zf-C2H2结构域是真正丝状真菌Ste12基因的重要特征[28]，但是鲜有对其功能研究的报道。对菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)的研究表明，zf-C2H2结构域的敲除不会影响该转录因子的DNA结合能力，本研究也证实PsSte12蛋白C端zf-C2H2结构域缺失不影响PsSte12的转录活性。但是，zf-C2H2结构域完整性被破坏之后会严重影响病原菌体果胶酶的产生及对聚苯乙烯的黏附，进而影响病原菌的致病力[29]，说明zf-C2H2结构域可能也参与了该转录因子对相关基因的调控。

利用转录激活域预测软件对该蛋白氨基酸序列的预测结果表明，在第144-152位存在匹配度很高的具转录活性的氨基酸序列。本研究发现，该转录因子的N端第1-340位具有转录活性，表明PsSte12的转录激活域很有可能就在预测的SDFLELLFK位点。进一步可以通过将该预测的转录激活位点进行突变或缺失，验证其是否具有转录激活活性。

利用组织细胞学对小麦与条锈菌亲和互作过程研究表明，夏孢子萌发产生芽管，于接种后12 h，在叶片气孔下腔内出现气孔下囊并产生初生侵染菌丝[30]；然后，初生侵染菌丝向气孔腔周围的叶肉细胞扩展，形成吸器母细胞[31]；接种后24 h，吸器母细胞入侵叶肉细胞产生吸器原体，然后分化出吸器颈和吸器体[30]；截至接种后48 h，初生菌丝的数目基本保持不变；接种48 h后，次生菌丝开始产生并大量形成。所以，接种后24和36 h是条锈菌开始形成吸器原体并最终形成成熟吸器的时期。本研究结果表明，PsSte12在接种后24和36 h相对表达量迅速升高，与条锈菌初生吸器形成的时间相一致，说明该转录因子可能调控与吸器发育相关的基因或者参与调节吸器对寄主细胞的扩展。