张明敬，史 慧

（江苏省连云港市畜牧兽医站，江苏 连云港 222001）

随着经济的发展，人们对食品的需求量越来越高，大量的养殖禽畜被送往动物检疫处，以往的检测方法耗时长，运行成本高，无法应付逐日递增的工作量。比如鸡胚病毒分离法，大概需要3周时间才能出检疫结果，大大降低了检疫处的工作效率。荧光PCR自上个世界90年代末发展起来后，逐渐被应用于禽流感的日常监测中，荧光PCR比普通PCR的敏感度高约10倍，可最大程度检测禽畜中的微量病毒。

1 检测样品

本文从当地的各大屠宰场进行取样，分别取普通鸡肉10份、鸡喉或泄殖腔拭子10份、鸡鸭血清各10份、鸡内脏10份。为了避免在取样过程中发生污染，样本用灭菌棉拭子粘取后放入加有PBS的灭菌小离心管中，对样本的采集均使用灭菌剪、灭菌刀，采集后将取得的样本置于2～8℃，如果在24h后不能被检测，则应置于-50℃的环境中保存。

2 试剂

试剂包括通用荧光RT-PCR试剂盒、RNA提取液、禽流感病毒H5、H7、H9亚型荧光RT-PCR 试剂盒、DEPC水、Taq酶、反转录酶、异丙醇以及 75%乙醇、生理盐水。

3 仪器

主要仪器有分析天平、荧光PCR扩增仪、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器、BioBard Chrom4型荧光PCR仪、台式高速冷冻离心机

3.1 试验方法

3.1.1 样本处理 每份样品分别处理。首先，组织样品处理，每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g左右，使用手术剪剪碎后取0.02g置于研磨器中研磨至均匀的粉状，加入1.5mL生理盐水继续研磨，直至研磨成均匀浆糊状后再转至1.5mL离心管中，8000转速离心2min，取上清液100μL置于1.5mL灭菌离心管中。……