邓 敏，梁光华

（重庆市涪陵区畜牧兽医局，重庆涪陵408000）

0 引言

布鲁氏菌病是布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患病。布鲁氏菌是胞内寄生的革兰氏阴性球状杆菌或短杆菌，无芽孢，有荚膜，无鞭毛不能运动，是在严格厌氧条件下不生长的需氧菌。1985年WHO将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型。近年随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR方法的广泛应用，基因分型技术已开始进入实验诊断和流行病学调查。目前，PCR方法对布鲁氏菌的实验鉴定以种鉴定为主，可以诊断布鲁氏菌属、种、型的范围，方法准确、可靠。并在该领域得到了广泛的应用，应用细菌学PCR方法对涪陵区的布鲁氏菌种、型开展病原学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

2014—2016年，从清溪镇2个养羊场通过虎红平板和试管凝集试验检测，确定为布病阳性羊场，从这2个场中采集的羊流产胎儿分别收集获得6份、4份，共10份组织样品，标记为试验样品菌株，标准菌株羊种3型阳性对照、阴性对照购自中国兽医药品监察所。

1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量标准PCR Markers（DL2000）购自大连宝生物工程有限公司，组织基因DNA抽提试剂盒购买于Qiagene公司；PCR反应引物由上海生工生物工程有限公司合成提供。

1.3 方法

（1）常规布鲁氏菌的鉴定。将10份样品菌毒株和1份阳性对照羊3型标准菌株进行生化培养实验。该实验在无菌环境下操作，分别将这10份样品加入布鲁氏菌肉汤0.5 mL中，使阳性对照冻干物溶解。取0.1 mL溶解物均匀涂布于布鲁氏菌琼脂培养基上，同时接种于布鲁氏菌肉汤培养基，置37℃培养48～96 h。根据菌落生长时间和形态、菌体染色等实验，并参照各菌生长特性判定其生物种、型。该实验在某三级生物安全实验室操作。

（2）PCR病原学检测。根据说明书操作，判定标准，在阴阳性对照成立的条件，根据DNA扩增带进行判定。该实验在某三级生物安全实验室操作。

2 结果

2.1 布鲁氏菌常规生化检测

样品进行布鲁氏菌常规检验，11个样品野菌株和标准菌株样品中，其中8份样品和羊3型菌株分离到无色、半透明，圆形、表面光华、边缘整齐、中央稍凸起，直径有2～3 mm菌落，有2份样品无细菌生长。用革兰氏染色，镜检，布氏杆菌染成红色。该菌对光、热、常用化学消毒剂等均很敏感；根据菌落生长时间和形态、菌体染色、血清学诊断等实验，并参照各菌生长特性判定其种型，结果8个样品与标准菌株的培养形态、染色一致。

2.2 病原学检测

将布鲁氏菌的羊3型标准株和8份阳性样品菌株共9株毒株的培养产物经PCR扩增实验，经过1.5%的琼脂糖电泳凝胶，扩增出731bp大小的目的片段，阴性对照无目的扩增片段。8份样品株与标准菌株片段一致，可以得出结论，涪陵区山羊布病病原为羊种3型。

3 讨论与分析

近年来，我国流行的布氏菌主要是牛种菌和羊种，患布鲁氏菌病羊是我国人间布病最主要的传染源，近年致病菌主要是羊种3型布鲁氏菌。一般羊种3型对人、畜均有较强的毒力和侵袭力，且致病力也较强，易引起布病的暴发和流行，且疫情重。涪陵区为黑山羊养羊特色区域，因此在未免疫的情况下，尤其需要需要对羊布鲁氏菌病采取有效可行的控制措施，严格按照法律法规来防止布鲁氏菌病的发生。

目前，涪陵区畜牧兽医局动物疫病预防控制中心与涪陵区卫生部门疾控中心已经开展沟通与合作，创建联防联控、群防群控的局面，实施长期监测、以及同步信息，建立布鲁氏菌病联合防控机制，各司其职，密切协助，互通疫情信息，共同做好涪陵区人畜共患病的防控工作、保障人民的身体健康、以及养殖业的绿色健康发展。

本实验通过对布鲁氏菌病PCR方法和细菌学常规检测方法的使用，结果证明样品PCR试验的检测和常规实验检测结果一致，而且使用PCR检测方法缩短了检测时间，同时该方法的首次使用，为涪陵区动物疫病预防控制中心兽医实验室能快速有效的诊断布鲁氏菌病奠定了基础。