王凤英，黄路圣，徐康，叶林华，黄云，李钊，徐进

（扬州大学附属泰兴医院 儿科，江苏 泰兴 225400）

过敏性紫癜（henoch-schoenlein purpura，HSP）是一种以小血管为主要病变的全身性血管炎，是儿童最常见的血管炎。至今HSP的发病机制尚未完全清楚[1]。研究表明，HSP急性期存在明显的免疫功能异常，包括体液免疫紊乱、T细胞亚群功能失调及细胞因子异常分泌等。细胞因子信号传导抑制蛋白2（suppressors of cytokine signaling，SOCS2）和 SOCS5是SOCS家族家族中重要的分子，研究发现其可调节免疫功能，影响免疫性疾病的发生、发展。本研究旨在研究SOCS2、SOCS5在儿童HSP中的表达及其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年9月-2015年6月扬州大学附属泰兴医院住院或门诊的HSP新发患者，对照组为门诊健康体检儿童。HSP患儿36例，诊断均符合中华医学会儿科学分会免疫学组制定的儿童HSP循证诊治建议[2]。HSP患儿均为初次发病，病程≤3 d，在受检前4周内未使用任何糖皮质激素或细胞毒性药物。其中，男性21例，女性15例；年龄（7.8±3.2）岁；单纯皮肤型8例，混合型28例（23例伴关节症状，16例伴消化道症状，5例伴肾脏损害）。对照组儿童17例均为无过敏性疾病史的健康儿童。其中，男性10例，女性7例；年龄（7.5±2.5）岁。正常受试者无严重心、肝疾患及恶性肿瘤病史，近期无呼吸道感染病史及免疫抑制剂应用史。两组儿童年龄、性别比较，差异无统计学意义（t=0.190和0.010，P=0.871和0.931）。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试对象家长知情同意。

1.2 材料与试剂

人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参基因，SOCS2、SOCS5、GAPDH的引物设计和合成由上海生工生物工程有限公司完成，目的基因和内参基因的引物序列见表1。逆转录试剂、SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自美国Thermo公司。

1.3 仪器与设备

低速离心机、TDZ5WS购自长沙湘智离心机仪器有限公司，低温高速离心机、Heraeus Multifuge XIR Thermo Fisher购自上海赛默飞世尔仪器有限公司，分光光度计、Eppendorf Biophotometer plus购自德国eppendorf公司，PCR仪为伯乐C1000 Thermal Cycle（美国Bio Rad公司），凝胶成像仪、Tanon3 500购自上海天能科技有限公司。

表1 PCR引物序列

1.4 方法

1.4.1 提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）使用肝素钠抗凝管采集HSP患儿治疗前和对照组儿童外周静脉血2 ml，用密度梯度离心法分离出PBMC，用Trizol悬浮，置于-80℃冰箱保存，待测SOCS2和SOCS5 mRNA含量。

1.4.2 mRNA提取和脱氧核糖核酸cDNA合成严格按照Trizol试剂盒说明书步骤，用PBMC提取总mRNA，然后将mRNA逆转录为cDNA，逆转录反应总体系为20μl，在0.2ml EP管中进行。

1.4.3 SOCS22、SOCS5基因表达检测反应体系为25μl，其中 SYBR Green Ⅰ 12.5μl，cDNA 0.3μl，正反向引物各0.3μl，加去核酸水至25μl。PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共39个循环。

1.5 统计学方法

数据处理采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较

两组患儿SOCS2和SOCS5 mRNA的表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），HSP组较对照组高。见表2。

2.2 不同临床类型HSP患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较

混合型HSP患儿SOCS2和SOCS5 mRNA表达水平与单纯型HSP患儿比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），混合型HSP患儿SOCS2和SOCS5 mRNA表水平较单纯型患儿高。见表3。

2.3 不同性别HSP患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较

不同性别HSP患儿SOCS2和SOCS5 mRNA表达水平比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 两组患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较（±s）

表2 两组患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较（±s）

HSP组（n =36） 20.995±7.571 7.253±1.036对照组（n =17） 6.603±1.566 3.992±0.817 t值 2.152 2.47

表3 不同临床类型HSP患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较 （±s）

表3 不同临床类型HSP患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较 （±s）

混合型（n =28） 26.926± 9.930 10.536 ±4.992单纯型（n =8） 4.050±1.176 3.060±2.263 t值 2.288 3.791

表4 不同性别HSP患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较 （±s）

表4 不同性别HSP患儿SOSC2和SOCS5 mRNA表达水平比较 （±s）

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3 讨论

HSP是儿童的常见病、多发病，发病率逐年增加，其发病原因目前认为非单一因素所致，是多种因素综合作用的结果。其可能机制为环境中的各种刺激因子作用于具有遗传背景的个体，引起T、B淋巴细胞免疫功能紊乱，激发B细胞克隆扩增，导致免疫球蛋白A介导的广泛的白细胞碎裂性小血管炎；血清中多种炎症细胞因子升高；凝血因素也参与其中，小血管局部可有血栓形成。近年来对T淋巴细胞亚群的研究较多，结果报道也不一致，但比较一致的是发现HSP患者存在Th细胞免疫功能紊乱，急性期体内存在Th1/Th2失衡，主要表现为Th2的优势活化[3-4]。Th细胞是免疫反应重要的调控/效应细胞，Th细胞失衡则引起免疫功能紊乱，协同其他因子导致免疫性疾病发生。新近发现的T细胞亚群CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）和Th17细胞亦是导致HSP免疫失衡的重要原因[5-6]。

研究证实，SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS5等均可参与Th细胞平衡的调节。SOCS1在Thl细胞中高表达，可抑制Th2细胞分化，促进Thl细胞的分化；SOCS3在Th2细胞中高表达，可通过抑制Thl细胞分化，促进Th2细胞的分化，使Th2型反应增强[7-8]。SOCS2可抑制Th2细胞的分化和发育，影响Ⅱ型过敏反应等免疫反应的发生，对Treg的稳定也发挥重要作用[9-10]；SOCS5主要表达在Th1细胞，正向调控Th1细胞分化，负向调控Th2细胞分化[11-12]。SOCS各分子间有相互作用，SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS5间存在相互作用。SOCS2能抑制SOCS1或SOCS3的表达[13]。TANNAHILL等[14]研究认为，SOCS2的表达可显著减少细胞因子刺激产生的SOCS3水平，促进白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）和IL-3信号，影响T淋巴细胞的增生；Thl细胞分泌SOCS1造成炎症发生的同时，SOCS5也升高，可能对机体起保护作用。SOCS分子是JAK-STAT信号通路重要的负反馈调节者，通过下调该信号通路调节单核巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞的发育、分化、活化和功能[15-18]，从而影响多种炎症因子的表达与释放，参与免疫性、炎症性疾病的发生、发展[19]。SOCS在免疫过敏性疾病的发生、发展中起重要作用[19]，研究证实，SOCS2、SOCS5参与类风湿性关节炎、哮喘等疾病的发病过程，SOCS1、SOCS3也参与多种免疫性疾病的发病[20-21]。

本研究检测36例HSP儿童急性期SOCS2、SOCS5基因的表达，与对照组相比，发现HSP组患儿SOCS2和SOCS5 mRNA表达升高，且混合型HSP较单纯型HSP患儿的表达量升高。结合前期研究，HSP患儿体内SOCS1、SOCS3表达升高，尤其以SOCS3升高更明显[22]，笔者分析，在HSP患儿体内多种因素的影响下，SOCS3的表达升高，促使HSP患儿表现为Th2的优势活化，SOCS1、SOCS2、SOCS5的表达适应性增高，但SOCS1、SOCS2、SOCS5的升高不足以抑制SOCS3引起的Th2细胞分化和活化。OHSHIMA等[23]研究发现，在哮喘动物模型中，SOCS5的过表达不能抑制TH2反应。本研究结果同样提示，在HSP中SOCS1、SOCS2、SOCS5等表达升高未能抑制Th2的优势活化。本研究同时发现，HSP病情越重，SOCS2、SOCS5的升高越明显，提示SOCS2、SOCS5与HSP患儿的病情有关。周月宏等[24]研究发现，SOCS2过表达可通过抑制肾小球系膜细胞炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子α的表达，而抑制其炎症反应；在HSP患儿中，尚不清楚SOCS2、SOCS5通过何种机制发挥抑制Th2型细胞反应。不同的SOCS成员可作为药物治疗的靶分子，药物通过干预SOCS蛋白的表达，影响细胞因子的分泌，从而治疗免疫相关性疾病[21]。由于发病机制和机体免疫系统网络自身调整功能的复杂性，上述SOCS分子在HSP患儿中升高的始动因素、参与HSP发病的分子机制，以及相互作用机制还有待进一步深入研究，为SOCS治疗HSP等免疫性疾病的临床应用提供实验和理论基础。

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