孟燕，张利平，元小冬，钱琳琳，张萍淑

脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells，ADSC）具有体内含量多、易获得、低免疫原性、高可塑性及自体移植无伦理问题等优点。ADSC源性神经元样细胞弥补了神经干细胞数量少、临床难以获取的不足，为神经系统疾病的细胞移植疗法奠定基础。自ADSC被发现以来，海内外学者从不同角度对ADSC向神经元样细胞诱导分化开展了大量研究，本文就ADSC向神经元样细胞诱导分化的研究现状进行综述。

1 ADSC的生物学特性

2001年ZUK等[1-2]首次从脂肪组织中分离出一种与骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）形态相似的成纤维细胞样细胞，称之为ADSC。他们发现在体外培养过程中ADSC表达具有多向分化能力基质干细胞的标志物--CD29、CD44；之后又有研究报道，ADSC不表达造血干细胞的表面标志物--CD34[3-4]，这证明了ADSC是一种成体干细胞。ADSC体外培养细胞周期分析也符合幼稚细胞的特点，大部分细胞处于静止期及DNA合成前期，少部分细胞处于增殖期。ZUK等[1-2，5]还发现，在一定条件下ADSC能够向多种细胞分化，即ADSC是具有多向分化潜能的间充质干细胞。ADSC增殖稳定、衰老性低，体外培养10代后细胞的增长速度仍未明显降低[5]，为ADSC体外培养与研究提供了必要条件。关于ADSC的生长特点、免疫表型、多向分化等方面的研究均从不同方面说明了ADSC是一种与BMSC相似且具有弱免疫原性和多向分化潜能的间充质干细胞[1-2，6]，因而引起众多学者的关注。

2 ADSC向神经元样细胞诱导及鉴定

2.1 化学诱导法

ZUK等[2]首次采用细胞培养基添加β-琉基乙醇对ADSC进行诱导，发现诱导后的细胞表达神经元特异性标志--神经元特异烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）和神经元核心抗原（NeuN）。叶长青、蔡亚楠等[7，8]参照ZUK的方法用β-巯基乙醇诱导成人ADSC向神经元样细胞分化，发现诱导后的细胞表达神经元细胞特异性标志物--NSE和微管相关蛋白2（Microtubule associated protein 2，MAP2），并未表达胶质细胞的标志物--神经胶质酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP），进一步观察后发现ADSC源性神经元在形态学和超微结构上与成熟神经元细胞高度相似。Ashjian等[9]利用含有胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛等物质的培养基对ADSC进行诱导，发现诱导后的细胞表达早期神经元的标志NSE、NeuN等，却并未表达MAP2和GFAP等成熟神经元和神经胶质细胞的标志。在此基础上，Saffodr等[10]用胰岛素、氢化考地松等试剂采用鸡尾酒式方法对大鼠源性ADSC进行诱导，发现诱导后细胞表达神经巢蛋白（nestin）、GFAP、NeuN、S-100蛋白和MAP2等神经元及胶质细胞的标志蛋白，并表达NR-1、NR-2亚单位的谷氨酸受体及生长相关蛋白43（Growth associated protein43，GAP43）、突触蛋白1（synapsin 1）和电压门控钙离子通道。

经典的化学诱导法是最早发现的诱导方法，常用的有β-琉基乙醇、丁基羟基茴香醚、二甲基亚砜等物质，其机制可能与化学试剂抗氧化功能引起的胞内变化有关。化学诱导法具有诱导时间短、诱导分化率高等优点，但诱导后的神经元样细胞存活时间短，限制了对其功能的深入研究。基于这些进一步研究应继续探索化学诱导法的最优试剂、最适浓度及如何延长诱导后细胞存活的时间。

2.2 因子诱导法

Razavi S等[11]利用碱性成纤维因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）分别将BMSC和ADSC诱导为神经球，然后用bFGF、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、B27进行神经诱导，对2种细胞分化过程中MAP2和GFAP的表达情况进行比较，发现ADSC源性神经细胞GFAP表达率较低，而MAP2表达率相似，得出ADSC比BMSC更适于向神经元细胞诱导分化的结论。另有学者发现ADSC神经元分化潜能与BMSC相似，但ADSC比BMSC有更高的增殖能力[12]。Taki Tiraihi等[13]以司来吉兰为预诱导剂，全反式维甲酸（All-trans retinoic acid，RA）和重组人刺猬因子（Recombinant human sonic hedgehog，shh）为诱导剂将ADSC向运动神经元样细胞诱导，并确定了诱导剂的最适浓度。深入研究后，再次将ADSC用B27、EGF、bFGF诱导为神经干细胞后用Shh、RA、脑源性生长因子（Brain derived growth factor，BDNF）等因子进一步诱导，发现诱导后的细胞表达运动神经元生长发育的标志物—胰岛素基因增强结合蛋白1（Insulin gene enhanced binding protein 1，Islet-1）、少突胶质细胞转录因子2（Oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2）、同源框基因HB9，且呈典型的神经元细胞形态[14]。

因子诱导法是从体内细胞分化的研究中发展而来，目前应用较多的因子有EGF、bFGF、BDNF等。因子诱导法有细胞毒性小、细胞存活率高等优点[15]，但各种细胞因子半衰期较短、难以保持持久活性因而限制了因子诱导法的使用。

2.3 基因修饰法

Nurr-1基因是孤儿核受体转录因子超家族中的一员，与胚胎发育、细胞分化及中脑多巴胺能神经元发育和存活密切相关。实验证实，Nurr-1基因具有促进胚胎干细胞、BMSC向神经元分化的作用[16，17]。在此基础上，Yang Y等[18]发现经慢病毒转染Nurr-1基因后ADSC的神经分化能力明显增强，为ADSC神经诱导方面提供了新方法。microRNAs（miRNAs）为真核生物中一类内源性的、具有调控基因功能的非编码RNA，其在生物发育和细胞分化中至关重要。miRNA-124、miRNA-9在大脑中含量丰富，在神经干细胞的分化及神经元突触形成过程中发挥着重要作用[19，20]。有学者报道朊蛋白可能通过调节miRNA-124--羧基端小结构域磷酸酶1（small C-terminal domain phosphatase 1，SCP1）轴发挥促进ADSC神经分化的作用[21]。此后，Hu F等[22]对RA诱导ADSC神经分化过程中miRNAs、靶基因和信号通路间关系网络进行的探究，有助于理解ADSC分化机制，寻找高效率的诱导方法。

目前为止ADSC向神经元样细胞诱导分化尚无一种公认的方法，后续研究可尝试阐明ADSC的神经分化机制，力图寻找一种安全、高效、可持续的诱导方法。

3 ADSC源性神经元样细胞功能研究

近年来在ADSC源性神经元样细胞的电生理特性、神经分泌功能等方面均有报道。Saffodr等[10]对ADSC源性神经元样细胞进行深入研究发现，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA，兴奋性神经递质L-谷氨酸同系物）可使其大量死亡，表明ADSC源性神经元样细胞已形成了功能性NMDA受体。Jang S等[23]发现经bFGF和腺苷酸环化酶激活剂诱导的ADSC源性神经元样细胞具有功能性离子电流。另有学者报道，ADSC细胞膜K+通道不能产生动作电位，ADSC源性神经元样细胞具有较高的静息膜电位，且受到高钾刺激后迅速去极化[24]，说明ADSC源性神经元的K+通道已发育完备，即ADSC源性神经元具有产生正常神经元功能的电生理基础。在ADSC源性神经元样细胞分泌功能方面，Taki Tiraihi等[14]利用荧光染料FM43-1、钙离子指示剂和电压敏感性染料等对ADSC源性运动神经元进行进一步研究发现，诱导后的细胞具有释放突触囊泡、支配肌管活动功能。另有实验发现，ADSC源性神经元样细胞具有分泌神经营养因子、BDNF及多巴胺的功能[25，26]。

目前研究表明，ADSC源性神经元样细胞电生理特性与正常神经元相似，并具有一定的神经分泌功能，但诱导后细胞是否为功能完备的神经元细胞及是否能够和宿主细胞整合发挥正常神经元接受刺激、产生及传导冲动功能还需深入研究。

4 ADSC治疗神经系统疾病的应用潜能

ADSC体内应用主要包括体外诱导分化后移植和移植后体内分化两方面。ADSC具有弱免疫原性、免疫调节性、释放营养因子等特性使其适用于神经系统疾病的细胞治疗。

4.1 缺血缺氧性脑病

缺血缺氧性脑病是脑血管疾病最常见的类型，考虑到药物治疗的局限性，寻找新的替代疗法是必要的。近年来各种干细胞被应用于缺血性脑病的细胞治疗，其中ADSC具有独特优势[27]。刘斌等[28，29]将ADSC源性神经干细胞移植到脑缺血大鼠模型中，发现其可上调大鼠脑缺血灶局部血管内皮生长因子表达，促进脑缺血区新生血管形成，从而发挥神经细胞保护和促进细胞功能恢复作用。另有学者发现，ADSC可能通过细胞替代和抗炎作用促进脑缺血小鼠神经功能恢复并改善其学习记忆能力[30]。此外，成人大脑的侧脑室室下区（subventricular zone，SVZ）及海马齿状回颗粒下层（subgranular zone，SGZ）存在具有再生能力的神经干细胞，激活这些细胞可促进内源性神经再生达到治疗神经系统疾病的目的。在此基础上，Oh SH、Schwerk A等[31，32]向小鼠脑损伤处注射ADSC后发现，SVZ神经干细胞增殖、分化增多并向脑损伤处迁移，表明ADSC能促进神经干细胞分化进而发挥修复神经功能的作用。以上研究可以看出ADSC可通过神经分化、旁分泌、免疫调节、促进内源性神经再生等方面对缺血缺氧性脑病起治疗作用。

4.2 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）

PD是一种由于黑质多巴胺能神经元死亡及神经传导通路中断导致的神经系统变性疾病。目前关于PD的治疗只能以改善症状为主，不能阻止病情的发展，更无法治愈，因此需要寻找一种有效的治疗方法。6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）可导致大脑黑质特异性变性并引发神经毒性反应，常被用于制作PD动物模型。Gu H等[33]对ADSC所分泌的物质是否具有保护细胞免受6-OHDA毒性的能力进行测试，发现ADSC培养液可以减轻6-OHDA造成的氧化应激反应和神经毒性，进而减少神经元死亡。另有学者报道ADSC源性神经干细胞可改善PD大鼠的行为活动，其机制可能与减轻大鼠脑内6-OHDA所致的氧化应激损伤有关[34]。Takahashi等[35]将ADSC源性神经元样细胞移植到PD大鼠模型中，发现其表达多巴胺能神经元标记物并能改善PD大鼠的运动症状。此外，对于1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四羟嘧啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、鱼藤酮等神经毒性物质制备的PD动物模型ADSC移植疗法均可提高其多巴胺水平、发挥神经保护功能[36，37]。ADSC源性神经元样细胞为PD的细胞替代疗法提供了新思路。

4.3 阿尔茨海默病（Azheimer disease，AD）

AD是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变，是老年期痴呆最常见的类型。AD以Aβ淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结为主要病理特征，目前AD的病因及发病机制尚未阐明，缺乏有效的治疗手段。目前干细胞移植法治疗AD的研究日益增多。Kim S等[38]将ADSC通过静脉和脑内定向注射到AD小鼠模型，发现两种方法均能减少Aβ淀粉样蛋白沉积并改善小鼠认知功能障碍。Ma T等[39]利用淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）/早衰素1（Premature senility 1，PS1）双转基因AD小鼠模型也证实了ADSC具有减少淀粉样蛋白沉积和恢复小鼠记忆功能的作用。目前研究表明，ADSC减少Aβ淀粉样蛋白沉积、改善临床症状是以ADSC分泌Aβ淀粉样蛋白水解酶中的关键酶--脑啡肽酶为理论依据[40]。ADSC移植治疗简便、安全，很可能成为将来治疗AD的一种新途径。

ADSC及ADSC源性神经元样细胞在治疗肌萎缩侧索硬化、亨廷顿舞蹈病、周围神经损伤等神经系统疾病动物实验方面均取得了不同程度的进展[41，42]，同时在欧洲等地初步开展了ADSC治疗缺血性卒中的临床研究，其疗效有待于进一步报道。

5 总结及展望

随着细胞生物学和组织工程学研究的不断深入，ADSC分离、培养、神经分化、分化后细胞检测及体内应用等方面均取得了突破性进展，使ADSC源性神经元用于治疗神经系统疾病成为可能。但其研究系统尚不完善，仍存在很多问题有待解决。目前主要的限制有：①缺乏ADSC特异性标志物，不能明确获取的细胞即为成体干细胞；②ADSC向神经细胞分化方法有很多，但ADSC体内及体外定向分化的基因调控机制尚未阐明，目前仍缺乏一种确定的分化率高、安全、持久的诱导方法；③ADSC向神经细胞分化的研究仍局限于形态学、神经特异性标记、电生理基础等方面，缺乏综合研究证实ADSC源性神经元样细胞为功能完备的神经元；④ADSC移植后改善宿主神经损伤功能机制不明，移植体内的ADSC是否适应体内神经、体液等环境继续生长分化有待进一步确定；⑤ADSC在神经分化过程中能否排除致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等改变尚属未知。尽管尚有问题需要解决，但是随着组织工程学和细胞生物学迅速发展，人们对其认识不断加深，ADSC未来极有可能取代目前的干细胞源而成为细胞工程学、基因学治疗神经系统疾病的载体。

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