俞璐，曹晓华，赵政，贺文迪，夏明

急性缺血性脑卒中以其高发病率，高致残率和高致死率的疾病特点[1]，严重危害人类生命健康。动物脑缺血模型可以模拟人类相应的脑缺血疾病，在众多局灶性脑缺血模型制备方法中，以Zea Longa于上世纪发明的大脑中动脉线栓法[2]（middle cerebral artery occlusion，MCAO）应用最为广泛，其特点及优势在于：无需开颅，创伤较小；缺血部位相对固定，可控性好；可实现脑缺血后再灌注，是理想的标准局灶性脑缺血动物模型[3]。但在模型制备过程中，易受众多因素影响，模型成功率、梗死体积大小、蛛网膜下腔出血发生率不尽相同，且该手术对人员操作技术要求较高，不同实验室、不同实验员制备的模型差异较大。笔者将通过自身操作经验结合既往文献报道，对线栓法制备MCAO模型谈几点个人体会。

1 动物选择

1.1 动物品系

目前MCAO动物模型多选用啮齿类小动物，其具有购买及饲养费较低，大、小鼠均具有神经功能损伤的评判标准，较易得到不同特性的转基因动物等优点[4]。大鼠基因具有与人类基因98%的同源性，遗传差异小，品种一致性好，神经系统发达，脑血管解剖结构与人类相似度高，其生理机能变异小，且具有较强的抗感染能力和生命力，是脑缺血研究中应用最为广泛的动物模型。Fischer-334、SD、Nistar等品系大鼠均可用于MCAO的动物模型，但不同品种大鼠在阻断大脑中动脉后体积大小和稳定性不同。国外研究者发现，Nistar大鼠MCAO平均脑梗死体积最小，梗死灶变异大；Fischer-334大鼠梗死体积最大，大脑中动脉变异小，动脉阻塞后形成的梗死体积一致性好，而SD大鼠居于两者之间[5]。但因鼠源问题，目前多选用性情温和、生长快、价格便宜的SD大鼠。SD大鼠在MCAO手术后，梗死体积较Nistar大鼠大，恒定性好，缺血半暗带所占体积明显小于Nistar大鼠。同时，考虑到大鼠雌激素水平对脑缺血损伤可能的神经保护机制[6，7]及激素水平的生理性波动对大鼠情绪的影响，笔者采用血管解剖结构更为清晰的雄性SD大鼠作为MCAO的动物模型。

1.2 体重和鼠龄

研究表明，大鼠大脑中动脉的长度和粗细与其体重形成正比[8]。目前多主张大鼠体重控制在250～300 g。笔者在实验中采用260～280 g大鼠，理由如下：鼠龄小，体重轻，对造模手术耐受性差；体重较轻的大鼠血管更细，手术时线栓不易插入，增加手术创伤；体重＞300 g的大鼠，血管增粗，线栓不能充分阻断血流，梗死效果不佳，而且术后能快速建立侧枝通路循环，不利于评估药物疗效。

2 术前准备

2.1 术前饮食

对于术前饮食，国内主流的观点是禁食不禁水，一般禁食时间为12 h[9]，其目的是防治麻醉状态下食物的返流和误吸。笔者在实验中发现，大鼠在禁食过程中体重可下降10～12 g，禁食后的大鼠在造模完成后3 d内精神状态差，食物摄入量少，容易因营养不良出现衰竭死亡。更有学者发现，葡萄糖/能量代谢障碍是引起缺血性脑损伤的主要原因[10]。因此，笔者主张在术前自由饮食以提高大鼠对手术耐受力，降低术后死亡率；手术时，将大鼠头部偏向一侧能防止食物返流和误吸引起的窒息。

2.2 麻醉

动物实验中较常用的麻醉剂包括乙醚、异氟烷、戊巴比妥钠和水合氯醛等。乙醚和异氟烷属于吸入性麻醉剂，作用时间较短，需要持续性给药，给药剂量不易控制，对呼吸道刺激较大，影响肌张力，需要借助气体麻醉设备，且异氟烷对脑缺血再灌注损害具有保护作用[11]，故脑缺血动物模型一般不予采用。戊巴比妥钠和水合氯醛均可通过腹腔注射，操作简单，是实验操作中使用最多的麻醉剂。研究证实，戊巴比妥钠在麻醉潜伏期有较剧烈的四肢强直、痉挛等表现，需要进入深度麻醉期后上述症状才能消失，而水合氯醛的麻醉潜伏期短于戊巴比妥钠，起效较迅速，同时对大鼠体温和呼吸运动的抑制作用小于戊巴比妥钠，但两药均有抑制心肌收缩的作用[12]。因水合氯醛价格低廉，起效较快，对大鼠呼吸、心率影响较小，故笔者在实验中采用10%水合氯醛（0.40 mL/100g）腹腔注射麻醉。但在麻醉过程中需要注意以下几点：按照比例现配现用，避光保存；抓取大鼠时避免过度挣扎，应轻柔有效；在左侧腹直肌旁侧0.5 cm进针，通常呈30～40°进针，深度为1.5～2.0 cm，避免右腹进针，以防刺中肝脏；当出现因麻醉剂过量致口鼻分泌物增多现象，可用镊子将舌头拉出置于偏侧防止误吸；严格按照动物体重计算麻药剂量，若首次剂量未完全麻醉，可根据麻醉程度逐步加量，一般加0.1～0.2 mL，1～2次，直至大鼠全身松软，不能自主活动，生命体征平稳，逐量给药亦能减少其对心功能的抑制作用，但麻药过量可致大鼠死亡；水合氯醛在临床上亦可用于治疗高热惊厥[13]，故使用该药麻醉特别需要注意术中及术后保暖，待大鼠苏醒后撤除保暖设备可降低死亡率。

3 线栓制备和插线深度

3.1 线栓的制备

线栓是制备MCAO模型的关键材料，Longa和koizumi作为最早采用线栓法阻塞大脑中动脉的研究者，两者在线栓头的处理上各有不同，Longa把小段尼龙线的一端在酒精灯火焰上烧灼使其融化成一个膨大的球状[2]，而Koizumi在尼龙线上均匀涂上硅树脂[14]，但由于技术要求高，线栓头处理标准不统一，易造成模型制作失败。线栓的材质、粗细、线头的形状和包被均影响到模型制备效果。为保证线栓规格的一致性，减少线栓对模型制备的影响，笔者在实验中采用北京西浓科技有限公司制作的成品线栓，线栓采用柔韧适度的单丝尼龙线（线直径0.26 mm，线长40 mm），经显微操作烧制而成，头端烧熔为半球形，头部直径（0.36±0.02）mm，前端20 mm包被多聚-L-赖氨酸，不改变线栓直径，距头端19～20 mm处黑色标记，头部形状圆润的线栓易于进入颅内而不刺破血管，同时也易于掌握插入深度，从而形成较稳定的脑梗死面积，大鼠死亡率较低。

3.2 线栓插入

体重250～300 g的大鼠目前较多采用线栓插入深度为从颈总动脉分叉部起18～20 mm[15]。笔者的操作经验，线栓插入深度为从颈总动脉分叉处插入约20 mm，即将线栓送入颈内动脉后，黑色标记点过分叉点约1 mm，感觉稍有阻力时即停止插入。同时线栓插入血管时，应注意以下几方面：由于目前采用盲插法居多，当线栓由颈总动脉进入颈内动脉后，极易误插入颈内动脉的分支翼腭动脉造成模型失败。笔者的操作经验是，当线栓进入颈总动脉分叉点后，应适当将其压低，保持线栓与水平线夹角15°左右，可有效降低插入翼腭动脉几率；颈总动脉分叉点的位置并不恒定，不应将分叉点的位置作为插入线栓深度的测量标志；当线栓插入阻力过大时，或由于血管扭曲所致，此时切不可猛插强插，可将线栓缓慢退出，让血管回复到解剖结构，待恢复血流后可再次尝试线栓插入；线栓插入过程中尽量不要多次的来回抽插，避免血管内膜损伤。

4 模型制备

4.1 手术器械

由于大鼠的血管和神经十分纤细，MCAO模型制备需要精密度较高的手术器械来完成。笔者在分离血管时选用显微镊，各型号头宽0.1～0.3 mm，能够有效分离颈总动脉、颈内和颈外动脉；为避免显微镊多次分离组织后头端毛糙，在分离肌肉组织时采用普通眼用镊。同时采用1 mL注射器的针头刺破颈总动脉留下大小合适的针孔便于线栓插入，注射器针头锋利且尖锐，刺破血管同时又避免割断血管。手术器械的选用在MCAO手术中尤为重要，恰当的器械可使操作过程中血管损害降到最低，减少出血量和手术时间，提高造模成功率。

4.2 手术切口

手术一般以颈侧部作为切口，为避免伤及左侧迷走神经造成对心脏的影响[16]，手术时以右颈侧为切口，长约2.0～2.5 cm，切口往下依次为：颌下腺、下颌淋巴结、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌等，右颈侧较易于进行肌肉和血管分离，视野暴露较好；如寻找血管困难，可适当扩展切口至3.0 cm，但操作时避免反复拨弄神经或探入切口过深损伤气管。

4.3 线栓插入位置与走向

线栓插入位置有自颈外动脉插入和自颈总动脉插入2种。但颈外动脉较细，插入过程中容易扯断或误剪断血管，操作难度大，故而笔者采用颈总动脉插入线栓法，其插入手法简单易行，且血管不易扯断，对气管刺激性小，血管损害仅在颈总动脉局部[17]。操作时，为避免术中出血及线栓插入颈外动脉，笔者先将颈外动脉结扎，在颈总动脉和颈内动脉各放置一根活线，以备线栓插入后固定线栓用。线栓走向即进入颈总动脉后，由颈内动脉入颅，进入大脑前动脉后回抽1～2 mm即插入大脑中动脉，此时，线栓黑色标记点滑入颈总动脉分叉点1 mm，脑缺血计时开始。值得注意的是，如果线栓进入颈内动脉约10 mm就感到阻力明显，则提示线栓极大可能误入颈内动脉上唯一的分支翼腭动脉，此时需要将线栓缓缓抽回，调整角度后重新插入。笔者在实验中发现，将线栓反复调整角度，仍极易插入翼腭动脉，考虑可能由于线栓本身弯度引起误插，此时建议换取新线栓再次插入，这也是制备该模型最常见的失败原因，需要术者付之耐心与细心。

4.4 缝合

术后缝合关于多余线栓的处理一般有2种，一种是埋在大鼠体内，另一种是留在大鼠体外。将线栓埋在体内是为了避免麻醉不充分的大鼠术后过度活动导致线栓脱出而致模型失败，但在拔线栓时，需要再次暴露和二次缝合切口。笔者发现大鼠麻醉逐渐苏醒过程中活动量明显减小，在操作中采用将多余线栓留于体外的方法，同时将线栓用记号笔涂黑标记便于识别。

5 术后再灌

国内研究者在术后24 h分别对脑缺血后30 min、60 min和90 min再灌注大鼠进行梗死面积评估，实验发现缺血后30 min再灌注损伤较轻；缺血后60 min基底核损伤较前者重，皮质有很轻微改变或无改变，病变不恒定；而缺血后90 min再灌注则在额顶叶皮质及基底核区形成面积相对恒定的梗死灶，术后神经缺损表现明显[18]，能够较好地模拟人脑局灶缺血后状态。国外研究者亦多采用缺血后90 min作为缺血再灌注损伤模型[19]。因此，笔者选择缺血后90 min再灌注，在大鼠体外伤口缝合处找到线头，轻轻拔出线栓2～3 cm剪断，若此时大鼠已完全清醒，可注射少量麻药后再将线栓拔出，以防拔线栓时大鼠过度挣扎加大损伤。

6 术后护理与并发症

术后更换干净垫料并将大鼠放回鼠笼，用60N白炽灯距离大鼠25～35 cm处持续照射直至其苏醒后再撤除，期间可将大鼠头部微微垫高，以防侧枝循环过快恢复。大鼠在术后1～3 d内并发症多，死亡率高，最常见的死亡原因包括：脑水肿；插线栓时用力过猛刺破血管致蛛网膜下腔出血；术中损伤迷走神经致呼吸抑制。因此，术者在操作中一定要动作轻柔灵活，切不可使用蛮力。眼部感染和癫痫是术后最常见的并发症，笔者使用金霉素眼膏在眼部感染处进行外涂，1次/d，3～5 d可缓解；癫痫是由于脑缺血致损伤神经元过多引起神经元异常放电，癫痫大鼠均不纳入实验。同时，笔者密切关注大鼠饮水量变化，对于术后极度虚弱，饮水量明显减少的大鼠，可予1%葡萄糖水灌胃，5 mL/只，2次/d，防止大鼠营养不良而致死亡。另外，应尽量保持垫料干燥，每日更换垫料，控制室温在25°C左右，可将食物放于笼中便于摄取，避免笼中大鼠只数过度、密度过高，这些因素均有利大鼠术后恢复。

7 模型评价

MCAO模型评价方法有多种，如神经功能评分、TTC染色、脑组织含水量、局部脑血流测定和头颅磁共振等。其中脑血流测定和头颅磁共振检查需要特定的仪器设备，费用高昂，其应用具有一定局限性。TTC染色和脑组织含水量测定需要处死大鼠，能够直观地了解大鼠脑缺血情况，且实验步骤简单易行，是MCAO模型最常用的评价方法。神经功能评分包括Bederson评分、Belayev评分、Clark评分等，其中Bederson评分是引用频率最高的神经功能评分标准[20]。神经功能评分法直观、简便，可以从整体角度观察动物神经损伤程度，无需借助特殊仪器设备，但相对于其他评价方法，该法主观、粗糙，无法准确描述神经损伤及恢复情况，故应用时，常常联合TTC染色和脑组织含水量测定评估模型而不将神经功能评分作单独使用。

8 结语

线栓MCAO模型的制备是目前研究脑缺血疾病最重要的手段之一，该模型也在不断完善与改进中。在模型制备中大体需要注意以下几点：①一般选用260～280 g SD雄性大鼠作为动物模型；②合理选用麻醉药物，现配现用，严格掌握药物不良反应与麻醉剂量；③手术操作规范化，采用合适的线栓，注意线栓插入的角度、深度与走向；④常采用缺血后90～120 min再灌注；⑤注意术后护理与并发症的发生；⑥选择合理的模型评价方法。在MCAO模型制备中，笔者发现该模型存在着一些局限性，包括同一体重范围的大鼠血管构造存在差异，导致线栓插入相同角度和深度，却造成不同程度的神经功能缺损；大鼠耐受性的不同会造成手术后缺血程度的不同。MCAO大鼠模型制备是一类精细手术，每一个环节都需要认真仔细的对待，作为脑缺血研究的实验基础，必须重视操作的每一个步骤，反复练习，同时不断地总结经验，这样才能提高MCAO模型制备的成功率。

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